上海市小容量注射剂过滤和灭菌工艺条件的调研及如何确保产品安全性的探讨

中图分类号：R953文献标识码：A文章编号：1006-1533(2007)08-0355-06

2006年“齐二药”、“欣弗”事件接连发生，注射剂产品的安全性问题引起了全社会的高度关注。作为药品生产企业和药品监管部门，如何找出影响注射剂安全性的一些关键因素，从药品生产工艺的研发和药品注册审评的源头就严把产品安全关，是值得我们共同思考的问题。

本文以对上海市最终灭菌的小容量注射剂灭菌和除菌工艺的调查结果为切入点，尝试进行分析和思考，以期引起有关药品生产企业和药品监管部门的重视，使注射剂的安全性得到进一步的保证。

1调查结果

对最终灭菌的小容量注射剂而言，产品的无菌是一个不言而喻的、非常重要的安全性指标。通常在最终灭菌的小容量注射剂的生产过程中，可使产品达到无菌的工艺方法有除菌过滤和湿热灭菌。然而，在对小容量注射剂生产企业的检查过程中，笔者发现不少过滤和湿热灭菌的工艺过程不能足以确保产品的无菌，企业对于如何确保灭菌的有效性认识不足，缺乏必要的管理措施。此外，原国家药品监管部门批准的部分小容量注射剂产品的过滤和灭菌工艺亦有值得商榷之处。

为此，上海市食品药品监督管理局认证审评中心GMP部曾于2003年对上海市生产湿热灭菌小容量注射剂的14家药品生产企业进行了专项调查。该次调查的药品生产企业既有国有企业，也有外资企业，调查的品种既有化学药品，也有中药制剂，制备工艺中包括过滤和湿热灭菌，但除菌过滤后不经湿热灭菌的品种不在该次调查范围内。该调查共涉及154种产品224个规格 (以被调查企业所生产的小容量注射剂品种之和计算，未扣除相同的品种数量)，旨在了解这些小容量注射剂产品的企业现行的和经国家批准的过滤和灭菌工艺条件。调查结果如表1至表6所示。

本文从调查的结果入手，重点探讨如何从除菌过滤和湿热灭菌工艺上确保小容量注射剂安全性的问题。本文中所述的安全性仅限定在与注射剂产品无菌有关的范围之内，即因除菌过滤和湿热灭菌条件不合理而不能确保产品的无菌，从而造成对患者身体的损害或损伤。

2调查结果的分析

2.1采用企业现行过滤和湿热灭菌条件的小容量注射剂产品的安全性存在较大隐患

《中华人民共和国药典》（2000年版）推荐使用的灭菌条件是：115.5 ℃暴露30 min、121.5 ℃暴露20 min或126.5 ℃暴露15 min。采用上述灭菌条件，还必须经过验证，证明其F0值不低于8才可认为符合灭菌要求。

该次调查中，采用115.5 ℃暴露30 min以上灭菌的小容量注射剂产品有25个品种35个规格，采用121 ℃暴露20 min以上灭菌的产品有12个品种19个规格，采用126.5 ℃暴露15 min以上灭菌的产品有1个品种1个规格（参见表2）。

采用《中华人民共和国药典》（2000年版）推荐的灭菌条件进行湿热灭菌的小容量注射剂产品仅有38个品种55个规格，分别仅占全部被调查产品的品种和规格的24.68％和24.56％（参见表1）。

《中华人民共和国药典》（2000年版）还要求：由于无菌保证值与污染菌耐热性及污染量有关，在药品生产的各个环节均应采取各种有效的手段（包括除菌过滤等措施）来降低待灭菌产品的微生物污染。

根据上述要求，针对采用《中华人民共和国药典》（2000年版）推荐的灭菌条件进行湿热灭菌的小容量注射剂产品，再进一步考察其除菌过滤的条件，发现其中有20个品种40个规格采用不大于0.22 μ除菌过滤器进行过滤，分别占全部被调查产品的品种和规格的16.23％和17.86％，而有13个品种15个规格未采用0.22 μ除菌过滤器进行过滤，分别占全部被调查产品的品种和规格的8.44％和6.70％（参见表3）。

这也就表明，被调查企业中仅有16.23％的小容量注射剂品种和17.86％的规格完全符合《中华人民共和国药典》（2000年版）关于湿热灭菌和除菌过滤条件的基本要求，如果假定企业在除湿热灭菌和除菌过滤以外的其他方面，如配液、灌装等，处于理想受控状态，则这部分产品可以被认为是安全的。

其余小容量注射剂产品中有112个品种164个规格采用的是100 ℃暴露15～45 min不等的湿热灭菌条件进行灭菌。

采用这样的条件生产的小容量注射剂产品，假如人们对微生物的知识稍加了解就不难判断其安全性如何了。以往的微生物学研究发现，细菌芽孢比其繁殖体具有更强的耐热性。炭疽杆菌的繁殖体在80 ℃只能存活2-3 min，而其芽孢在湿热120 ℃需10 min才能杀灭，肉毒杆菌芽孢在湿热120 ℃可存活4 min，而在100 ℃需330 min才能杀灭。所以要杀灭芽胞，湿热灭菌的温度应大于100 ℃。

Warth研究了细菌最适和最高生长温度与其芽孢耐热性之间的关系，发现随着细菌繁殖体最适生长温度的增高，其芽孢的耐热性就增强。适宜于较高温度（55～67 ℃）生长的微生物，如嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）等对湿热的抵抗力最强。因此，嗜热脂肪芽孢杆菌已成为湿热灭菌过度杀灭法的生物指示剂，即通常以是否能杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌作为指标之一来评估灭菌工艺的效果。

100 ℃暴露15～45 min的湿热灭菌条件，其灭菌过程的F0值不能达到8，也不能完全杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂。此外，笔者在对生产上述产品的企业进行GMP认证等各类检查中，极少见到有企业按照《中华人民共和国药典》（2000年版）的要求，除用生物指示剂进行湿热灭菌工艺的验证外，还在生产过程中连续地对微生物进行严格监控，证明灭菌后无菌保证值不低于设定的标准。大部分企业不知道应如何对这样的湿热灭菌条件进行有效的验证，不清楚检测灭菌前药液中的微生物污染量的重要性和必要性，仍然采用过度杀灭法灭菌的验证方法计算F0值或使用嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂。

因此，这部分小容量注射剂产品的无菌保证值未经有效验证证实可达到6，即灭菌后微生物存活的概率不大于10-6，从这个意义上来说，这部分产品的安全性是值得怀疑的。

针对100 ℃暴露15～45 min湿热灭菌的被调查产品，再进一步考察其过滤的条件，发现灭菌前采用0.22 μ除菌过滤器进行过滤的有70个品种和104个规格，分别占全部被调查产品的品种和规格的45.45％和46.43％，而未采用0.22 μ除菌过滤器进行过滤的有42个品种和60个规格，分别占全部被调查产品的品种和规格的27.27％和26.78％（参见表4）。

这表明，超过1/4的小容量注射剂产品完全不能符合《中华人民共和国药典》（2000年版）关于除菌过滤和湿热灭菌条件的基本要求，再加上企业对灭菌工艺验证的不完善，因此，这部分产品严格地说是不安全的。

2.2国内的药品主管部门对小容量注射剂产品的过滤和湿热灭菌条件的控制不严

由于被调查企业中有不少产品的注册申报资料遗失，无法对被调查的所有产品品种和规格做一个全面的分析，但仅从已知国家批准的湿热灭菌工艺的128个品种和185个规格的产品来看，完全符合《中华人民共和国药典》（2000年版）推荐的湿热灭菌条件的产品品种和规格分别仅有21个和30个，分别仅占16.41％和16.22％；而采用100 ℃暴露15～45 min湿热灭菌条件的产品品种和规格分别有98个和145个之多，分别占76.56％和78.38％；采用其他灭菌条件的产品品种和规格分别有5个和6个，分别占3.91％和3.24％；未作明确规定的产品品种和规格均有4个，分别占3.12％和2.16％（参见表5）。这说明有75％以上的小容量注射剂产品获得国家批准的湿热灭菌条件不符合《中国药典》(2000年版)推荐的要求。

再从已知国家批准的过滤工艺的128个品种和182个规格的产品来看，使用0.22 μ除菌过滤器或等同的滤器进行过滤的品种和规格分别仅有16个和27个，分别占12.50％和14.84％；使用0.45～1.2 μ的过滤器进行过滤的产品品种和规格分别有102个和140个，分别占79.69％和76.92％；未作明确规定的产品品种和规格分别有10个和15个，分别占7.81％和8.24％（参见表6）。这说明有75％以上的小容量注射剂产品获得国家批准的过滤工艺不符合《中国药典》(2000年版)除菌过滤的要求。

这样的状况使得GMP检查员即使发现了企业生产的小容量注射剂产品存在过滤和湿热灭菌工艺上的缺陷，也无法制止企业的不合理行为，因为，在未获得药品主管部门正式批准重大工艺改变之前，企业必须严格按照已批准的生产工艺进行生产，不得擅自更改，这既是《中华人民共和国药品管理法》的规定，也是中国《药品生产质量管理规范》（1998年修订）的要求。在此，合理性与合法性产生了严重的冲突和矛盾。

2.3出口的小容量注射剂产品比内销的产品在湿热灭菌条件上更严格

该次被调查的企业中有一家企业同时生产出口和内销的小容量注射剂产品，对同一品种和规格，这家企业针对出口和内销的产品分别设定不同的湿热灭菌条件，出口产品的灭菌条件是121 ℃暴露20 min，而内销产品的灭菌条件是100 ℃暴露30 min。

这种内外有别的做法提示我们：国内对于小容量注射剂产品的安全性要求已经落后于国际标准，同时，这种国际标准对于国内的企业而言是可以达到的，而不是遥不可及的。

该次调查还发现，由外国人直接管理的合资企业生产的小容量注射剂产品在湿热灭菌和除菌过滤的条件上全部能符合《中华人民共和国药典》（2000年版）的要求甚至更为严格。例如，有一家合资企业规定的湿热灭菌条件是121℃（F0＝24）。这同时也印证了国际上对于小容量注射剂产品的安全性要求比我们国内更严。

3思考与讨论

通过对该次专项调查结果的分析，笔者在此提出一些问题予以思考和讨论：

1)为什么会出现为数不少的被调查的小容量注射剂产品的湿热灭菌和除菌过滤工艺的无菌保证程度不足，安全性令人怀疑？究其原因，是落后的、不科学的传统观念在作祟。

在对药品生产企业的检查中，笔者时常发现部分企业人员对于消毒和灭菌的概念模糊，将两者混为一谈，因此，有必要在此进行澄清。

消毒是指清除或杀灭外环境中的病原微生物及其它有害微生物。在对“消毒”一词含义的理解上，有两点需要强调：消毒是针对病原微生物及其它有害微生物的，并不要求清除或杀灭所有微生物；消毒是相对的而不是绝对的，它只要求将有害微生物的数量减少到无害的程度，而并不要求把所有有害微生物全部杀灭。

灭菌是指用物理或化学的方法清除或杀灭一切活的微生物，包括致病性微生物和非致病性微生物。灭菌的概念是绝对的而不是相对的。灭菌方法通常有湿热灭菌法、干热灭菌法、化学灭菌法、除菌过滤法和辐射灭菌法等。

由于种种原因，要做到完全无菌是困难的。国际上，一般用无菌保证值来表示物品被灭菌后的无菌状态，其定义为灭菌产品经灭菌后微生物残存概率的负对数值，数值越大，无菌状态越完全，但灭菌后微生物残存的概率不可能为零。按国际标准规定，湿热灭菌法的无菌保证值不得低于6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于10-6。

消毒和灭菌的定义清楚地说明，对于小容量注射剂产品而言，要达到无菌只能采用灭菌的方法而不是消毒的方法。在调查结果的分析中所提到的100 ℃暴露15～45 min的湿热灭菌条件在未经验证证实其无菌保证值可达到6之前，只能视作是消毒。但在企业甚至监督管理部门中，仍有不少人错误地认为它就是灭菌，长期以来国内的小容量注射剂产品的生产都是采用这种传统方法进行“灭菌”，并觉得其安全性是没有问题的。因此，这也就很好地解释了为什么有不少产品在待“灭菌”前不进行除菌过滤。

当然，需要指出的是，对于不适用除菌过滤的产品应例外，可采取其他的方法。

有些人可能会认为，尽管从理论上讲，100 ℃暴露15～45 min的条件不足以确保无菌，但为什么经过这种“灭菌”处理的小容量注射剂产品都能通过无菌检验？

其实，这些人对无菌检验的局限性缺乏认识。从统计学角度考察，如果采用抽样检验的方法，那么，含有少量微生物污染的产品批次也有可能“通过”无菌检验；而且，一批产品的染菌率越低，根据无菌检验的结果来判定整批产品的无菌，其风险就越大。从非统计学角度考察，无菌检验的结果实际上还与微生物生长的条件有关。到目前为止，没有一种培养基能使所有的细菌、酵母菌和霉菌都能生长，所以如果要保证这些微生物适宜地存活和生长，就必须使用多种培养基，但究竟用多少种培养基才合适呢？迄今没有定论。另外，培养温度和时间也会影响到微生物的生长。因此，仅凭无菌检验合格的结果就判定整批产品无菌是难以让人完全信服的，只有对灭菌的过程进行有效的验证并在实际生产中严格控制，才能确保小容量注射剂产品有足够的无菌保证程度和安全性。

针对这些错误的、不科学的传统观念，建议药品主管部门加强宣传与小容量注射剂有关的国内外先进的制药科学知识，帮助人们尽快更新观念，跟上科技发展和时代进步的步伐。

2)正是由于监管部门中有些监管人员也有这些错误的观念，致使在小容量注射剂产品的注册审批中，药品主管部门未对湿热灭菌和除菌过滤等会影响产品安全性的因素提出严格的审评要求，设立严格的审评标准。

在国际上，无论是美国FDA还是欧盟都要求注射剂产品的申请人应提交灭菌工艺研究方面的资料。例如，美国FDA的《人用和兽用药品申请时提交灭菌工艺验证文件的指导原则》（1994年）就详细说明了需最终湿热灭菌的药品申报时所需提交的灭菌程序资料,其中包括：对产品及灭菌程序的说明；灭菌程序的热力学确认；灭菌程序的功效；环境的微生物检测；容器－胶塞系统及包装的完好性；细菌内毒素试验及其方法；制订及遵循正式书面规程的证据。

通过要求企业提交上述资料，实际上也就是要求申报企业必须对产品的湿热灭菌事先进行深入、细致、严密的研究，从产品申报之初就对其安全性进行严格把关。

但在国内，药品主管部门尚未针对注射剂产品的注册申请制定出专门的详细的申报资料要求，也就是说，申报企业未被要求提交注射剂产品灭菌程序的详细资料。纵览2002年10月15日颁布的《药品注册管理办法》（试行）及其5个附件，未发现其中包含这种要求，而这正是对注射剂产品的安全性进行源头监管的一个盲点。

为此，建议国家食品药品监督管理局从完善药品监管系统的角度出发，在对国内注射剂产品调研的基础上，结合研究国外注射剂产品的注册管理要求，确定专门的、详细的注射剂产品申报资料要求，包括需企业提交灭菌程序资料等，设定严格的、科学的、合理的审评标准，并对已有药品批准文号的注射剂品种重新按照新的标准进行审查，推动和促使企业尽快对注射剂产品的安全性进行充分的研究，改进小容量注射剂产品的除菌过滤和湿热灭菌工艺。

一旦小容量注射剂产品确定了严格的、科学的、合理的除菌过滤和湿热灭菌工艺，并经过药品主管部门批准后，GMP的检查就有了合法、合理的依据，也不会在检查过程中陷入合理性与合法性彼此冲突和矛盾的两难境地，GMP检查员也就可以理直气壮地要求企业对小容量注射剂产品的除菌过滤和湿热灭菌过程进行有效的验证并严加控制。否则，即使国家食品药品监督管理局早在2002年底就限期生产小容量注射剂产品的企业必须通过GMP认证，即使注射剂的GMP认证划归国家食品药品监督管理局负责的范围，即使国家食品药品监督管理局对生产注射剂的企业进行GMP认证后的跟踪检查，小容量注射剂的安全性问题仍然不可能从根本上得到解决，也不可能将GMP认证的工作引向深入，引向更高的层次。

3)小容量注射剂的生产企业应如何确保除菌过滤和湿热灭菌工艺的有效性，如何严格控制其工艺？建议企业根据产品的特性，科学设计除菌过滤和湿热灭菌的工艺，针对不同的湿热灭菌方式，制定相应的、必要的控制措施。

湿热灭菌按照验证方式的不同可分为过度杀灭法、生物负载／生物指示剂（联合使用）灭菌法和生物负载灭菌法。

对于热稳定性强的小容量注射剂产品，建议采用过度杀灭湿热灭菌法。该法不管待灭菌的物品中微生物污染的数量和耐热性如何，都力求达到无菌保证值为6，通常可用使D121.1℃至少为1 min的微生物数量的对数值最少降低12来证实。只有最耐热的微生物其D121.1℃才会大于0.5～1.0min，耐热性较差的微生物理所当然会被杀灭从而达到更高的无菌保证值。挑战用的微生物的D值和最少降低12个对数值的最低目标是用来计算灭菌时间的，用于计算被灭菌物品的F0值。过度杀灭法不要求对待灭菌物品上的微生物数量进行日常监控，只要定期进行监控即可。但是，在验证期间应全面检测是否出现耐热细菌芽孢，并与挑战用的微生物比较其耐热性。

例如，欧洲药典中要求的过度杀灭的标准程序是121.1℃暴露15 min，采用这种灭菌程序可以不必使用生物指示剂。但即便是采用过度杀灭法，对小容量注射剂的药液在灌装前进行微生物污染水平的控制仍然是WHO要求采用的措施之一，而除菌过滤可以有效地达到降低微生物污染水平的目的。

对于只有中等强度热稳定性的小容量注射剂产品，可用生物负载／生物指示剂（联合使用）灭菌法。该法在无菌保证值达到6时，允许部分生物指示剂未被杀灭，但所使用的生物指示剂的D值应大于待灭菌产品中所含有的普通微生物的D值。在对热稳定性较差的产品进行验证时，使用有耐热性的生物指示剂通常是有必要的，可通过允许生物指示剂的部分存活从而避免被灭菌物品过度受热。这种方法提供了可以与生物负载比较的无菌保证值，尽管仍需使用生物指示剂，但所做的验证比生物负载灭菌法更简单。

例如，如果灭菌前的生物负载不大于100 CFU／个容器，D121.1℃为0.2 min，采用使有耐热性的生物指示剂（D121.1℃为0.5 min）芽孢数量降低4个对数值的湿热灭菌程序可使无菌保证值不小于6。

对于热稳定性差的小容量注射剂产品，可采用生物负载灭菌法。该方法应足以杀灭待灭菌物品上的微生物，又不致于造成产品的降解。生物负载灭菌法是在对产品中微生物的数量和耐热性进行详细研究的基础上建立的。一般说来，只有生成芽孢的细菌需要测定D值，对产品在80～100 ℃进行热休克处理10～15 min可以剔除不耐热的微生物。一旦已知生物负载的耐热性后，就可以确定灭菌程序，使微生物存活的可能性不大于10-6。对生物负载灭菌法而言，分离出来的最耐热的微生物应作为生物指示剂，且通常在灭菌前应对每批产品的生物负载进行检测和评估。由于生物负载／生物指示剂（联合使用）灭菌法可达到同样的无菌保证程度而不需要企业自制挑战用的生物指示剂，所以生物负载灭菌法未在制药企业中广泛使用。

除过度杀灭法以外，使用生物负载／生物指示剂（联合使用）灭菌法或生物负载灭菌法都必须制定生物负载监控的计划，并从下列几个方面予以考虑：环境的季节变化、从配液到灭菌的时限（应包括预定的最大时限）、样品的均一性、产品批量的变化，还应测定每个容器或每升产品内微生物的数量和种类。根据这些数据，可建立暂时的标准作为内控标准，直至收集到其它数据后再制定最终的警戒限和行动限。生物负载监控的计划还应有明确的取样频率、取样数量、取样方法、检验方法和可接受的标准。

WHO对采用过度杀灭法灭菌的小容量注射剂药液仍然建议在灌装前进行微生物污染水平的控制，因此用生物负载／生物指示剂（联合使用）灭菌法或生物负载灭菌法生产的小容量注射剂，其药液在灌装前更应进行微生物污染水平的控制（如采用除菌过滤），这对于保证产品的安全性而言，其重要性更是不言自明了。

4结语

长期以来，人们都熟悉这样的说法：要是生了病，可以吃药的不要打针，可以打针的不要输液。这种说法虽是用药的一个基本法则，但从另一个侧面反映了人们对注射剂产品的安全性无法彻底放心的心态。

随着灭菌科学技术的发展和国内药品监管的要求不断提高，药品主管部门应继续完善药品监管体系，消灭监管的盲点，进一步加强对注射剂产品安全性的监管，特别应重视从注射剂产品的注册申报之初就严格把关。只要各药品监管的职能部门齐心协力，再加上生产企业的共同努力，就可以提升注射剂产品的安全保障度，从而进一步提高用药的安全性。

(收稿日期：2007-07-04)