黄河故道地区葡萄根结线虫rDNA- ITS-PCR研究

摘 要： 用PCR方法扩增来自黄河故道地区不同区域葡萄根结线虫群体的ITS片段，并进行克隆和序列分析。结果表明，来自6个不同采集点的供试线虫属于同一种群，获得的ITS序列长度为766 bp，与已知南方根结线虫ITS区编码序列一致性达到99.74%；聚类结果显示，与南方根结线虫亲缘关系最近。结合形态鉴定结果，初步确定黄河古道地区葡萄根结线虫病病原为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。

关键词： 葡萄； 根结线虫病； 南方根结线虫； ITS-PCR； 序列分析

中图分类号：S661．1 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－1104－03

Study on rDNA -ITS-PCR of root-knot nematode in grape in the Chinese Yellow River east region

LIU San-jun1，2， YU Qiao-li2， LI Hong-lian1*

（1Plant protection College，Henan Agricultural University， 2Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan 450000 China）

Abstract: The amplification， cloning and sequencing of the rDNA-ITS region of 6 different populations of root-knot nematodes from trail of the Yellow River east region were conducted. The sequence analysis results showed that six populations of root-knot nematodes on grape from Luoyang， Zhengzhou， Kaifeng， Shangqiu in Henan Province and Dangshan， Xiaoxian in Anhui Province belong to Meloidogyne incognita. The length of ITS was 766 bp. The results of the sequence analysis and the form identifications showed that this pathogen was Meloidogyne incognita.

Key words: Grape； Root-knot nematode disease； Meloidogyne incognita； ITS-PCR； Sequence analysis

自1889年Neal首次报道加州的葡萄发生根结线虫病[1]以来，葡萄根结线虫病已成为制约葡萄生产的世界性病害，危害日益严重。危害葡萄的根结线虫在世界的分布主要有4种：南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、花生根结线虫（M. arenaria）、爪哇根结线虫（M. javanica）和北方根结线虫（M. hapla）[2-3]。

葡萄种植在黄河古道地区有悠久历史，伴随而来的葡萄根结线虫病普遍发生，对葡萄生产和育苗造成很大的危害[4]，但病原线虫种类却未有明确报道。近年来，分子鉴定已应用于根结线虫的分类鉴定中并取得了很大的进展[5-7]。ITS是核糖体DNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区，它们在生物进化过程中显示种的特征，在种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是最广泛应用于寄生虫种间分类鉴定的理想遗传标记[8-11]。我们对本地区的葡萄感病病株进行了病原线虫的分离培养，从形态学和分子生物学两方面对其进行鉴定，以明确黄河故道地区的葡萄根结线虫种类，为线虫病害防治、线虫与寄主间的分子互作、抗线虫基因的筛选和利用等提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

于2008年6月采集感染线虫葡萄根系，带回试验室，用强水流冲洗，选择膨大根结，挑取成熟雌虫和卵囊备用。其编号和来源见表1。

1.2 方法

1.2.1 根结线虫形态鉴定 将成熟卵囊置灭菌水中，25 ℃培养24 h。收集二龄幼虫，在显微镜下观察其形态并照相。挑取成熟雌虫，观察其形态并照相。 鉴定标准参照刘维志等[12]的方法。

1.2.2 根结线虫DNA提取 参考欧师琪等[6]的方法并加以改进，具体方法为：挑取1个成熟卵囊放入灭菌的Eppendorf管中捣碎，加入10 μL灭菌重蒸水，25 ℃培养24 h，获得二龄幼虫，充分搅匀后去杂质，-20 ℃冷冻2 h，用灭菌牙签的端部充分研磨2~5 min，再加入9 μL蛋白酶K溶液（1 g・L-1）（Promega，USA） ，离心30 s，继续-20 ℃冷冻2 h，将Eppendorf管置65 ℃下温浴1 h，95 ℃ 10 min，最后12 000 r・min-1 离心1 min，取上清DNA悬浮液-20 ℃保存备用。

1.2.3 ITS-PCR扩增 选择扩增线虫rDNA-ITS区的通用引物，序列为：引物1（18S）：5’-TTGA TTAC GTCC CTGC CCTT T-3’引物2（28S）：5’-TTTC ACAC GCCG TTAC TAAG G-3’。

采用50 μL的PCR反应体系，10×PCR Buffer 5 μL，引物各1 μL，模板DNA 10 μL，Premix Taq DNA 多聚酶25 μL，灭菌重蒸水补足到50 μL。 扩增条件为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶（含EB）100V电泳30 min，紫外检测、照相。

1.2.4 PCR产物的回收 PCR产物采用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，具体操作步骤参照试剂盒操作说明。

1.2.5 PCR产物的克隆、测序和序列分析 将纯化后的PCR产物进行连接转化，提取重组质粒DNA，经PCR鉴定后，筛选出含有正确插入片段的重组克隆送上海英俊公司测序。将测定的序列在NCBI中利用BLAST程序进行同源性搜索，采用DNAMAN、CLUSTALX、MEGA等分子生物学软件对克隆片段与已报道的根结线虫序列进行同源性比对，并生成系统聚类图。

2 结果与分析

2.1 病原线虫形态鉴定结果

挑取病株根结进行观察，可以看到根结外有透明黄褐色胶质包含着的卵囊，在显微镜下可以看到卵囊里充满了长椭圆形的卵，挑取卵囊，可以看到与卵囊紧密相连的呈梨形的雌虫，虫体乳白色，前体部突出呈现为瓶颈状，后体呈现为球形，食道垫刃型，中食道球发达，具有口针（图版-A）。二龄幼虫线形，长度约为500 μm，头部可以看到发育良好的食道腺和口针（图版-B）。观察到的形态特征与刘维志[12]对根结线虫的特征描述相一致，由此初步判断病原线虫为根结线虫。

2.2 根结线虫rDNA-ITS的PCR扩增结果

对ITS-PCR扩增结果进行电泳检测，得到大小约为800 bp（图1）的6个ITS片段， 说明从6个不同地区采集到得根结线虫的ITS片段大小一致。

2.3 序列分析及同源性比较结果

测序结果表明，6个线虫样品的ITS序列长度一致，均为766 bp，且碱基序列无差异，说明属于同一个种；在NCBI上进行序列对比，发现它与南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的ITS区编码序列（序列号为AY438556）具有极高同源性，一致性达到99.74％，ITS序列的聚类分析结果见图2。

3 讨 论

根结线虫的鉴定方法主要分为形态鉴定和分子鉴定2种，形态鉴定又以雌虫会阴花纹和同工酶鉴定方法为主，但雌虫会阴花纹个体间常常存在差异，并且在标本制作上需要一定的技巧，同工酶鉴定虽然较为准确，但却需要年轻雌虫的存在，因而限制了该方法的应用[12]。近年来国际上兴起的根结线虫各虫态分子诊断方法的研究，不仅灵敏、快捷、准确，而且可操作性强、重复性好、适用范围广，在多种果树根结线虫病害以及多种线虫群体的鉴定上发挥了重要作用。

试验采用根结线虫rDNA-ITS-PCR扩增的方法，用一对扩增根结线虫ITS区通用引物对我国黄河故道地区葡萄根结线虫群体进行了鉴定，首次明确了该地区危害葡萄的根结线虫种类为南方根结线虫（M. incognita）。为今后黄河故道地区葡萄根结线虫的研究和防治提供了理论依据，为葡萄抗线虫基因克隆、抗线虫育种奠定了基础。

目前，由于抗线虫基因的单一性，而大部分化学杀线剂都会引起环境污染，因此，快速准确的对病原线虫的鉴定，对于应用葡萄抗线虫性、抗性砧木的筛选、检疫以及防治根结线虫病害，确保葡萄的高产及安全生产具有极其重要的意义。（本文图版见插5）

参考文献 References:

[1] RASKI D J，KRUSBERG L R. Nematode parasites of grapes and other small fruits in Plant and Insect Nematodes[M]. （W. R. Nickle ed.）Marcel Dekker， INC. New York and Basel，1984: 457-506.

[2] PONGRACZ D P. Factors influencing the practical value of a rootstock for grapevines[M]. New Jersey: Barnes & Noble Books，1985.

[3] TACCONI R. I nematode parassiti delle piante da frutta， delta vite e delta fragola[J]. Informatore Fitopatologico，1984（4）: 63-72.

[4] WU Qing， YANG Bao-jun. Investigation and identification of root-knot nematodes on plants in Henan[J]. Henan Agricultural Science， 1988（1）: 17-19.

吴青，杨宝君. 河南省根结线虫种类调查鉴定初报[J]. 河南农业科学，1988（1）: 17-19.

[5] MENG Qing-peng， LONG Hai， XU Jian-hua. PCR assays for rapid and sensitive identification of three major Root-knot nematodes， Meloidogyne incognita， M. javanica and M. arenaria[J]. Acta Phytopathologica Sinica，2004，34（3）: 204-210.

[6] OU Shi-qi， PENG De-liang， LI Yu， WANG Yong-jiang. Restriction fragment length polymorphism and sequences analysis of rDNA-ITS region of cereal cyst nemotode（Heterodera avenae） on wheat from Zhengzhou[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2008，38（4）: 407 -413.

欧师琪，彭德良，李玉，王永江. 河南郑州小麦禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）的核糖体基因ITS序列和RFLP分析[J]. 植物病理学报，2008，38（4）: 407-413.

[7] ZHAO Hong， PENG De-liang， ZHU Jian-lan. Reviews on the root-knot nematodes[M]. Plant Protection//Plant Protection，2003: 29（6）: 6-9.

赵鸿， 彭德良， 朱建兰. 根结线虫的研究现状[M]. 植物保护，2003: 29（6）: 6-9.

[8] BLOK V C，PHILLIPS M S，FATGETTE M. Comparision of sequence from the ribosomal DNA intergenic region of Meloidogyne mayaguensis and other major tropical root-knot nematodes[J]. Journal of Nematology，1997，29（1）: 16-22.

[9] BLNK V C， PHILLIPS M S， FARGETE M. Comparison of sequence from the ribosomal DNA intergenic region M. mayaguensis and other major tropical root-knot nematodes[J]. J Nematol，1997，29: 16-22.

[10] HUGALL A， STANTON J， MORITZ C. Reticulate evolution and the origins of ribosomal internal transcribed space diversity in appomictic Meloidogyne[J]. Mol Boil Evol，1999，16: 157-164.

[11] XU J， NARABU T， MIZUKUBO T. A molecular marker correlated with selected virulence against the tomato resistance gene Mi in M. incognita， M. javanica， M. arenaria[J]. Phytopathology，2001， 91: 377-382.

[12] LIU Wei-zhi. Plant nemotodes[M]. Beijing: China Agricutural Press，2004.

刘维志. 植物线虫志[M]. 北京: 中国农业出版社，2004.