皮肤鳞状细胞癌组织和细胞系中Ptch?1及Gli?1表达的检测

作者：白育萍，刘海燕，高滢，刘玉峰，李承新

【摘要】 目的：探讨hedgehog信号传导通路中ptch?1和gli?1在鳞状细胞癌皮损和细胞系中的表达及意义. 方法 ：采用免疫组化技术分别检测鳞状细胞癌皮损和细胞系a431,hsq?89,hsc?2和tca中ptch?1和gli?1的蛋白水平表达与分布. 结果：ptch?1及gli?1在正常皮肤，鳞状细胞癌皮损，细胞系a431，hsq?89以及hsc?2细胞中均有阳性表达，主要分布在鳞状细胞癌细胞胞膜及胞质中. 结论：鳞状细胞癌皮损和细胞系中ptch?1及gli?1的阳性表达可能通过激活hedgehog信号传导通路有助于鳞状细胞癌的形成和 发展 .

【关键词】 hedgehog基因；信号传导通路；免疫组化；癌,鳞状细胞

【abstract】 aim: to investigate the expressions and significance of ptch?1 and gli?1 in the squamous cell carcinoma lesions and the cell lines. methods: immunohistochemical techniques were employed to detect the distribution and expressions of ptch?1 and gli?1 in squamous cell carcinoma lesions and a431, hsq?89, hsc?2 and tca squamous cell carcinoma cell lines. results: the re were significant expressions of ptch?1 and gli?1 in the squamous cell carcinoma lesions, normal tissue and in a431, hsq?89 and hsc?2 squamous cell carcinoma cell lines,and they were mainly distributed in the cell membrane and cytoplasma. conclusion: expressions of ptch?1 and gli?1 might contribute to formation and progression of squamous cell carci?noma via activating hedgehog signaling pathway.

【keywords】 hedgehog; signal transduction pathway; immunohistochemistry; carcinoma, squamous cell

0 引言

皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, scc）是皮肤科临床上常见的表皮肿瘤之一,近年来其发病率明显上升.虽然scc的发生与基因突变及烃类化学物质的接触等因素相关［1］,但迄今为止,scc的发病机制尚未完全阐明.既往 研究 显示,hedgehog（hh）信号传导通路在scc发病中有可能起着重要作用［2］.为进一步探讨hh信号传导通路与scc之间的关系,我们运用免疫组化方法，观察scc皮损和多种scc细胞系hh信号转导途径的靶基因gli?1和patched?1(ptch?1)的表达情况.

1 材料和方法

.1 材料 2004/2006经西京 医院 皮肤科临床和病理确诊为皮肤scc存档蜡块30（男19，女11）例,年龄51～76(平均66.2±4.6）岁. 选取15例正常皮肤组织作为正常对照组. tca人scc细胞株（第四军医大学西京医院全军皮肤病研究所实验室保存）；a431人scc细胞株（ 中国 上海中科院细胞库）；hsq?89，hsc?2人scc细胞株（日本reken cell bank）；dmem(gibco公司)；胎牛血清（杭州四季青公司）；二甲基亚砜（西安化学试剂厂）；倒置显微镜（日本olympus公司）；ptch?1和gli?1抗体 (美国santa cruz公司)，两种抗体的工作浓度均为1∶200.免疫组化试剂盒及dab显色试剂盒（北京中杉公司）.

1.2 方法 免疫组化采用abc法,石蜡切片脱蜡,梯度乙醇至水,pbs洗3次，30 ml/l h2o2?甲醇室温浸泡5～10 min，枸橼酸盐缓冲液（ph 6.0）进行抗原微波加热修复60 min,冷却至室温后用1∶50的正常马血清室温孵育20 min, 加20 ml/l bsa稀释至1∶200的一抗gli?1和ptch?1置于湿盒内，4℃冰箱孵育过夜（12 h）.分别加20 ml/l bsa稀释至1∶200生物素标记的抗山羊和抗兔二抗, 37℃孵育30 min, dab显色,显微镜下观察,适时终止反应,苏木精复染15～30 s，脱水、透明、封片后，光镜下观察，每组实验均以已知阳性切片（基底细胞癌）作阳性对照,分别以pbs溶液代替一抗做阴性对照.

将tca，a431，hsq?89和hsc?2细胞以5×104/孔接种在铺有载玻片的培养皿中,37℃在co2孵箱中培养过夜，分别用含0.5 ml/l新生小牛血清的dmem (tca)，高糖dmem(a431，hsq?89，hsc?2)同步化2 d,用冷丙酮固定细胞15 min,pbs洗涤5 min×3次，空气中 自然 晾干；蒸馏水冲洗，pbs浸泡5 min；30 ml/l h2o2?甲醇室温孵育5～10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性;pbs冲洗2 min共3次；50～100 ml/l正常山羊血清封闭，室温孵育10 min. 倾去血清，勿洗，加20 ml/l bsa稀释至1∶200的一抗gli?1和ptch?1置于湿盒内，4℃过夜；pbs冲洗2 min共3次；滴加1∶50稀释的生物素标记的二抗，37℃孵育30 min；pbs冲洗2 min共3次. 显色剂显色（dab）,自来水充分冲洗，复染、脱水、透明、封片. 用pbs代替一抗做阴性对照，用已知阳性片做阳性对照. 免疫组化结果scc细胞胞质或胞膜着棕黄色为阳性. 随机选取4个非连续的高倍镜视野计数，评分标准按染色强度及阳性细胞数来 计算 评分［1］：① 染色强度：0为阴性，1为弱阳性，2为阳性，3为强阳性；② 阳性细胞计数：0为无阳性细胞，1为阳性细胞数＜10％，2为阳性细胞数10％～50％，3为阳性细胞数＞50％. ①＋②之和为最后得分，得3～6分者为免疫组化染色阳性.

统计学处理: 采用spss 13.3统计软件处理进行χ2验检, p<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 gli?1和ptch?1在scc组织中的表达 正常皮肤组织中gli?1阴性14例，阳性1例，4例基底细胞癌均阳性. 皮肤组织中gli?1阳性18例（60.0％，18/30）,阴性12例,阳性染色仍定位于胞质. 正常皮肤组织中ptch?1阴性13例,阳性2例,皮肤组织中ptch?1阳性19例（63.3％，19/30）,阴性11例,阳性染色定位于胞质，差异均有统计学意义（1:χ2=11.66,p<0.01;2：χ2=10.04, p<0.01,图1).

2.2 gli?1和ptch?1在scc细胞株中的表达 gli?1和ptch?1在细胞株a431，hsq?89和hsc?2细胞中均呈阳性表达,gli?1蛋白在a431细胞株和hsq?89细胞株中阳性染色定位于胞浆,在hsc?2细胞株中gli?1阳性染色定位于胞质,部分胞膜也有阳性染色. 而在tca细胞株中gli?1蛋白未见表达（图2）.ptch?1蛋白在a431细胞株和hsq?89细胞株中阳性染色定位于胞质,而在hsc?2细胞株和tca细胞株中均未见表达（图3）.

a: gli?1; b: ptch?1.

图1 gli?1和ptch?1在鳞状细胞癌组织中的表达 sp ×400（略）

a: a431; b: hsq?89; c: hsc?2; d: tca.

图2 gli?1在鳞状细胞癌细胞中的表达 sp ×400（略）

a: a431; b: hsq?89; c: hsc?2; d: tca.

图3 ptch?1在鳞状细胞癌细胞中的表达 sp ×400（略）

3 讨论

hh信号通路是一个高度保守的调控胚胎发育的信号通路,在胚胎发育过程中起着十分重要的作用, 参与了人类一些肿瘤的发生与 发展 ［2］，hh信号转导通路相关分子的突变可导致肿瘤的形成,如基底细胞癌、鳞状细胞癌等［3-4］. 目前 关于hh信号转导通路在基底细胞癌中的重要作用已经得到国内外学者的公认［5］. hh信号转导通路由十数个分子组成,我们之所以选用ptch?1和 gli?1作为 研究 对象,是因为在既往研究中已充分证实ptch?1和gli?1是hh信号转导通路中起关键作用的结点之一：ptch?1不仅是hh信号的受体,同时是hh信号转导通路的目的基因,是该信号传导通路重要的负反馈调节因子,ptch?1基因失活与许多先天性疾病及肿瘤发生密切相关；而gli?1是hh信号转导通路下游的一个重要因子,起着承上启下关键性的调控作用,gli?1在肿瘤发生、发展及恶性维持中的作用不容忽视［6］.既往研究发现,在皮肤scc皮损中有ptch?1和gli?1的表达,免疫组化及原位杂交结果均显示阳性颗粒主要分布于scc细胞胞质中,胞核无明显着色［7］. 有学者发现在scc细胞系a431和ka中发现有patched mrna的突变,细胞系hsq?89,ho?1u?1和t3m?1 clone?2中有shh,patch,smo和gli的表达,但是在细胞系tca,hsc?4,sa3,scctf,scctf和scckn中未有阳性表达［8-9］.我们用免疫组织化学的 方法 检测了皮肤scc皮损中ptch?1和gli?1的表达情况, 再次验证了scc皮损中hh信号转导通路处于激活状态.我们发现,在scc皮损中,ptch?1和gli?1阳性表达增强,阳性表达部位主要是癌细胞胞质中,在肿瘤组织的血管内皮细胞中也有部分阳性着色.检测hh信号转导通路在多种皮肤scc细胞系中的表达结果显示,4个皮肤scc细胞系中有3个细胞系呈阳性表达,gli?1蛋白在a431细胞系和hsq?89细胞系中在胞浆表达,在hsc?2细胞系中主要在胞质表达,部分胞膜也有表达,而在tca细胞系中gli?1蛋白未见表达.ptch?1蛋白在a431细胞系和hsq?89细胞系中主要在胞质表达,而在hsc?2细胞系和tca细胞系中均未见表达.这些结果均提示在皮肤scc皮损和细胞系中hh信号转导通路处于激活状态,为进一步深入研究hh信号转导通路在scc发病及 治疗 中的作用提供了依据.

【 参考 文献 】

［1］ potti a, moazzam n, langness e, et al. immunohistochemical determination of her?2/neu, c?kit (cd117), and vascular endothelial growth factor (vegf) over expression in malignant melanoma［j］. cancer res, 2004,130(2): 4655-4659.

［2］ saldanha g. the hedgehog signaling pathway and cancer ［j］. j pathology, 2001,193: 427.

［3］ chen y, struhl g. dual roles for patched in sequestering and transducing hedgehog ［j］. cell, 1996,87(3):553-563.

［4］ incardona jp, gaffield w, lange y, et al. cyclopamine inhibition of sonic hedgehog signal transduction is not mediated through effects on cholesterol transport ［j］. dev biol, 2000, 224(2): 440-452.

［5］ 刘 瑛，李承新，刘玉峰. hedgehog信号通路与基底细胞癌［j］.国外医学皮肤性病学分册，2005，31（5）：320-322.

［6］ cohen mm. the hedgehog signaling network［j］. am j med genetics, 2003, (123): 5.

［7］ 刘 瑛，李承新，刘玉峰. 皮肤鳞状癌中patched?1和gli?1蛋白检测及mrna表达的研究［j］.