放射线照射引起胶质瘤细胞细胞周期和凋亡的动力学变化及其对Chk1/2蛋白表达的影响

【摘要】 目的：观察非同步化的U251细胞株对放射线所表现的细胞周期和凋亡的变化以及放射线对chk1、Chk2蛋白表达的影响。方法：以不同剂量的放射线处理非同步化的U251细胞株，流式细胞仪检测处理后不同时间细胞周期和凋亡的变化，流式细胞仪和Western blot法检测照射后Chk1、Chk2蛋白表达量。结果：非同步化的U251细胞株经放射线处理后可引起G2/M期阻滞，细胞周期阻滞呈照射剂量依赖性增强，而细胞凋亡均发生于细胞周期阻滞解除后，其强度与细胞周期激活的程度成反比。照射后不影响Chk1、Chk2蛋白水平的表达。结论：放射线处理非同步化的U251细胞株可成功地建立G2/M期阻滞模型，但对Chk1、Chk2蛋白水平表达无影响。

【关键词】 胶质瘤； 细胞周期； 细胞周期检测点激酶； 照射； 凋亡

Effect on Cell Cycle and Expression of Chk1 and Chk2 after Irradiation in Glioma Cells/LI Yong， LAI Run-long， CHEN Yu， et al.//Medical Innovation of China，2012，9(12)：008-010

【Abstract】 Objective： To observe the changes of cell cycle and the apoptosis of unsynchronized U251 cell line and effect on Chk1 and Chk2 protein after the irradiation. Methods： The changes of cell cycle and apoptosis in U251 cell line which were treated with irradiation after different intervals by flow cytometry were observed. The expression of Chk1 and Chk2 protein was measured by flow cytometry and Western blot. Results： G2/M cell arrest induced in unsynchronized tumor cells after treated with irradiation. Cell cycle arrest increased with the increased dosage of irradiation， and apoptosis happened after cell cycle arrest and had inverse relationship with the activating cell cycle. Irradiation had no effect on expression of Chk1 and Chk2 protein. Conclusion： G2/M cell arrest models successfully induced in unsynchronized U251 cell line after treated with irradiation.

【Key words】 Glioma; Cell cycle； Checkpoint kinase; Irradiation; Apoptosis

First-author’s address： First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College， Shantou 515041， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.12.004

放疗在胶质瘤临床治疗中占有举足轻重的地位，放疗的疗效好坏很大程度上取决于DNA损伤检测点的功能状态。目前国外研究多采用同步化处理的肿瘤细胞来建立G2/M阻滞模型[1]，本研究采用更能真实反映细胞内在生物学特性的非同步化的肿瘤细胞，研究放疗作用下，胶质瘤细胞的细胞周期和凋亡的内在动力学变化并讨论放射线损伤对Chk1和Chk2蛋白表达的影响，以了解胶质瘤细胞中Chk1和Chk2对照射后细胞周期的调控作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系培养及照射 本课题采用人胶质母细胞瘤U251细胞株，由武汉大学典型物保藏中心提供。在37 ℃恒温培养箱内对U251细胞进行复苏、培养至对数生长期，再进行传代。将5×105细胞接种于6孔板中，室温下采用瑞典Elekta公司SLi型直线加速器，250 Gy/min 6 MV X线照射分别给予6 、10 、15 Gy三种剂量的照射。于6、12、24、48、60 h收获细胞和上清，800 r/min离心5 min，加入75%冰乙醇1 ml固定，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率(PI法) 取出固定的细胞，制成单细胞悬液，离心洗涤后加入75%的冰乙醇1 ml固定过夜。再次洗涤离心后加入500 μl染液(240 μl PBS、10 μl RNase(1 mg/ml)、250 μl碘化丙锭(50 μg/ml)(propidium iodide， PI))，室温避光孵育20 min，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。

1.2.2 Western blot法检测Chk1、Chk2蛋白表达量 收集的U251细胞，裂解后离心，将上清转管后于-80 ℃冻存，采用Bradford方法测定Chk1/2蛋白质浓度。收集的蛋白质样本采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别检测Chk1/2蛋白及磷酸化的Chk1-S345及Chk2-T68蛋白的表达量。

1.3 统计学处理 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，P

2 结果

2.1 U251细胞株细胞周期和凋亡的动力学特点 人胶质瘤细胞系U251经过6 Gy的射线照射后，引起的G2/M期阻滞较弱，当剂量增加至10 Gy，照射24 h后引起非常显著的G2/M期阻滞，达77.35%，并在一定范围内呈现明显的时间依赖效应和剂量依赖效应(见图1)。

随着时间延长(24 h后)，阻滞于G2/M期的细胞开始释放，一部分细胞继续进入细胞周期，而另一部分细胞走向凋亡，表现为细胞凋亡明显增加(见图2)。而当剂量增加至15 Gy时，没有出现明显的细胞周期阻滞现象，而直接表现为凋亡的增加。

时间(h)

图1 U251细胞照射后细胞周期阻滞趋势示意图

时间(h)

图2 U251细胞照射后细胞凋亡趋势示意图

2.2 Western blot法检测U251细胞照射后Chk1和Chk2蛋白的表达 接受不同剂量射线照射后，U251细胞中Chk1、Chk2蛋白表达水平与未照射相比均无明显变化。采用磷酸化抗体检测发现，照射前后Chk1-S345无明显磷酸化；但照射后6 h，Chk2-T68即出现明显的磷酸化，12 h达到峰值，24 h后Chk2-T68磷酸化水平开始下降，至60 h Chk2-T68磷酸化水平已基本趋于正常，但Chk2-T68磷酸化水平与照射剂量无关，6 Gy与10 Gy照射后相同时间点Chk2-T68磷酸化水平无明显差别(P>0.05)。见图3。

A

图3 Western blot法检测照射后Chk1/2蛋白表达

注：A：不同剂量射线照射24 h后Chk1、Chk2、Chk2-T68蛋白表达；B：10 Gy射线照射后Chk2-T68磷酸化水平随时间变化量

3 讨论

在长期进化过程中，机体形成了一套防止DNA发生损伤/错误的细胞周期监控机制，使机体遗传信息能够准确无误地传递到子细胞，这一套监控机制统称为DNA损伤检测点。在放疗条件下，DNA损伤检测点的激活，有利于肿瘤细胞DNA损伤/错误的修复，客观上为细胞的生存提供了条件，本质上是一种细胞的自我保护程序[2]。

本研究发现，U251细胞株在正常培养条件下主要处于G1/G0期，这与体外培养的其他哺乳动物细胞生长特性相似[3]。对胶质瘤U251细胞株进行射线照射处理后建立了U251细胞G2/M期的细胞周期阻滞模型，发现10 Gy射线照射24 h后引起非常显著的G2/M期阻滞，并在一定范围内呈现明显的时间依赖效应和剂量依赖效应。随着时间延长(24 h后)，阻滞于G2/M期的细胞开始释放，一部分细胞继续进入细胞周期，而另一部分细胞走向凋亡，表现为细胞凋亡明显增加。目前研究发现，照射所致的G2/M期阻滞比G1期阻滞更为普遍，大部分肿瘤细胞在接受照射后表现为G2/M期阻滞，而仅有p53(＋)和Rb(＋)表型的细胞接受照射后产生G1期阻滞，因为只有p53和Rb正常，且有p21参与时，细胞受到照射时才产生G1/S期阻滞，而大部分肿瘤细胞存在p53或Rb异常，因而丧失了G1/S期检测点的功能，仅保留了G2/M期检测点的功能，成为肿瘤细胞在损伤刺激下出现的自我保护机制的最后一道屏障[4]。

由于正常终末细胞的细胞周期基本处于停滞状态，大多数细胞均处于G1期，当其接受照射后依然表现周期停滞状态，无G2/M期阻滞表现，因此，封闭正常细胞的Chk1，Chk2其效果将较肿瘤细胞为差，因为Chkl和Chk2主要参与G2/M期阻滞，所以，封闭Chk1，Chk2本身就有肿瘤特异性，具有较强的靶向性，这将有利于扩大肿瘤治疗的治疗窗，提高治疗效果[5]。

研究还发现，U251细胞接受不同剂量的照射处理后，引起细胞周期阻滞的程度有一定的差异，在6 Gy的射线作用下，仅引起较轻微的G2/M期阻滞；在10 Gy射线作用24 h后，G2/M期阻滞达77.35%；当照射剂量增加至15 Gy时，则没有明显的细胞周期阻滞现象，而直接表现为凋亡的增加。这是因为当损伤较小或有望修复时，细胞通过一系列调节机制抑制细胞周期的进行，抑制DNA的复制，阻止细胞的分裂，为DNA修复系统提供充足的时间进行DNA修复，若修复成功，细胞继续进行或完成下一个细胞周期事件，若不能修复，细胞则发生凋亡[3]。同时，在观察U251细胞周期和凋亡的动力学变化中发现，细胞周期阻滞的程度在一定范围内表现为照射剂量依赖性增强，而细胞凋亡均发生于细胞周期阻滞解除后，其强度与细胞周期激活的程度成反比。

本研究发现，在接受不同剂量射线照射后U251细胞中Chk1和Chk2蛋白表达并不受影响，这与以往文献报道结果相一致[6]。Chk1和Chk2激酶主要在磷酸化激活后发挥作用，Chk1激酶第345位丝氨酸是其激酶激活的重要磷酸化位点[7]。本研究发现，射线照射后并不影响U251细胞中Chk1-S345的磷酸化，原因在于Chk1-S345主要由药物作用后被磷酸化，但Chk1激酶对照射后细胞周期检测的点功能维持也非常重要。照射后主要以Chk2激酶磷酸化激活为主，Chk2激酶第68位苏氨酸磷酸化在Chk2激酶激活中极为关键[8]，Chk2-T68被磷酸化后，继而引起Chk2自动磷酸化和激酶激活。照射后只影响Chk2-T68的磷酸化水平，不影响Chk1、Chk2蛋白水平的表达，磷酸化水平高低与照射剂量无明显关系。

参考文献

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[3] Schorl C， Sedivy J M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells[J]. Methods，2007，41(2)：143-150.

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[5] Qinghua Liu， Saritha Guntuku， Xian-Shu Cui， et al. Chk1 is an essential Kinase that is regulated by Atr and required for the G21M DNA damage checkpoint[J]. Gene and Development，2000，14(12)：1448-1459.

[6] Wu X， Chen J. Autophosphorylation of checkpoint kinase 2 at serine 516 is required for radiation-induced apoptosis[J]. J Biol Chem，2003，278(38)：36163-36168.

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(收稿日期：2012-02-23) (本文编辑：王宇)