改进的线栓法对不同品系小鼠脑缺血模型的构建

[摘要] 目的：建立不同品系小鼠局灶性脑缺血（MCAO）模型的通用方法。方法：健康雄性昆明（KM）小鼠和C57BL/6小鼠各20只，随机分为对照组10只，MCAO组10只，改良线栓法制作小鼠MCAO模型；大脑中动脉血流监测，栓塞24 h后行神经行为学评分，TTC染色测定脑梗死体积百分比，对模型可靠性进行评价。结果：KM和C57BL/6小鼠MCAO模型组脑血流监测显示梗死处血流基值下降比分别为（81.65±4.59）%，（83.68±6.25）%，神经功能评分分别为（2.30±0.82），（2.50±0.80）分，体征明显，TTC染色可清晰地显示出梗死范围且相对稳定，C57BL/6小鼠有1只TTC染色梗死灶不明显，24 h成活率KM和C57BL/6小鼠分别为100%，80%。结论：颈总插线法制作小鼠脑缺血模型无需开颅，创伤极小，缺血的部位较恒定，从模型制备中线栓、温度、麻醉各个关键环节加以优化和改良，使该模型的制备更加完备。

[关键词]小鼠；大脑中动脉栓塞；动物模型；插线法

脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，具有高致死率、高致残率和高复发率的特点，最新研究[1]显示，脑卒中已严重威胁人们的生命和生活质量。缺血性卒中是由于脑血管（主要为大脑中动脉）或其分支的血栓性或栓子性阻塞所致，约占所有类型卒中的80%[2]。大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型为目前研究局灶性脑缺血再灌注损伤最广泛的模型，该模型的经典方法为线栓法[3]，多运用于大鼠的研究。但大鼠成本高，且不能满足脑缺血基因水平研究，因此小鼠成为该实验动物的首选，但关于构建小鼠MCAO模型的研究不多[4]，且大鼠、小鼠体质、血管韧性、解剖结构等各方面的差异，因此需要构建完善的、理想的标准化小鼠脑缺血模型。

1 材料

1.1 动物 昆明小鼠，20只，雄性，体重（25±2） g，由军事医学科学院实验动物中心SPF实验室提供，许可证号SCXK-（军）2012-0004。C57BL/6小鼠，20只，雄性，体重（25±2） g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012-0001。随机分为对照组10只，MCAO缺血组10只，术前12 h小鼠自由活动，禁食不禁水。

1.2 试剂 水合氯醛和多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号20130321），酒精（邯郸市捷利康商贸有限公司，批号131208），TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，美国Sigma公司，批号10109622），小鼠线栓（广州赛迅生物技术有限公司）。

1.3 仪器 常规手术器械及显微手术器械（上海医疗器械有限公司手术器械厂），体式显微镜（上海精密仪器仪表有限公司），激光多普勒血流仪（瑞典Perimed公司）。

2 方法

2.1 线栓准备 将统一规定规格的线栓（头端直径0.23 mm±0.02 mm）利用记号笔在线栓头端9 mm处用记号笔标记，以便准确的控制进线的深度，将其消毒后备用。

2.2 手术步骤 小鼠称重，选取5%的水合氯醛以8 mL・kg-1比例腹腔注射麻醉，仰卧于手术台上，将颈部备皮乙醇消毒后，沿颈部正中进行切口，暴露并钝性分离下颌腺体，显微镜下在右侧的肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌和二腹肌形成的三角处分离出右侧的颈总动脉（CCA），用电凝笔烫断游离出的小分支，分离出颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），仔细分离避免损伤迷走神经，舌、咽神经和气管，用5-0医用真丝编织线将ECA，CCA结扎，另在CCA上打一手术活结，颈内动脉用显微动脉夹夹闭，在颈总动脉上做一切口，将备好的线栓插入颈内动脉到标记处或者直到略感阻力为止，即插入线栓从颈外动脉分叉处9 mm左右，扎紧活结。此时，线栓前端已经阻断大脑中动脉（MCA）起始段及其所有血液供应，造成MCA局灶性缺血，缝合皮肤。手术过程中要保证室温恒定在25 ℃左右，手术结束后放置于恒温清洁笼中卫生饲养。对照组不做任何处理，假手术组按照实验组步骤处理，但是不插入线栓，观察动物情况。弃去手术超过15 min或手术中有出血及麻醉过深的动物。 通过激光多普勒脑血流仪测量小鼠大脑中动脉栓塞后的局部脑血流变化。监测大脑中动脉线栓阻断血流程度，证实模型的成功与否。

2.3 术后的神经功能评分及TTC染色 整个评分采用单肓法，即评分者不知道实验动物分组情况。采用Longa的5分评分标准[3]（0分：无神经损伤症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：行走向对侧旋转；3分：爬行时身体向对侧倾倒；4分：不能自己行走或意识丧失）。1～4分为有效模型。 术后12，24 h后断头取脑，迅速置PBS冰水混合物中，5 min后取出置小鼠脑槽中，行1.0 mm厚的冠状切片，将切片立即置于0.5%TTC磷酸缓冲液中，避光、37 ℃恒温孵育15 min。将染色后脑片置于4%多聚甲醛中固定后，将脑片按脑的前后顺序整齐排列。用数码相机拍摄染色后的脑片，输入计算机内，用图像处理软件计算脑梗死面积。根据公式：体积=100×（对侧半球体积-未梗死的同侧半球体积）/对侧大脑半球体积[5]，算出梗死体积的百分比。

2.4 统计学方法 应用Image J软件对TTC染色结果进行图像分析。处理数据以±s表示，应用SPSS 17.0统计软件，行单因素方差分析，P

3 结果

3.1 小鼠脑缺血后神经病学评分 MCAO造模3 h后，小鼠苏醒，恢复反射和自主活动。假手术组未见异常，模型组动物均出现提尾悬空时头向左歪，对侧前肢屈曲内收、肩内旋，肌张力降低，不能完全伸直，自主活动时以对侧后腿为圆心向对侧旋转，甚至倾斜，神经功能学评分结果见表1。

3.2 小鼠脑缺血后血流监测 小鼠脑缺血后，脑血流基值下降显著，建模成功率较高（P

3.3 小鼠脑缺血后脑梗塞体积计算 假手术动物TTC染色的脑切片上，两侧皮层呈均匀的橘红色，未见梗死灶。阻塞小鼠脑切面可见较大的苍白色梗塞区，与正常的脑组织（橘红色）界线较明显，TTC染色结果见图1，2。

4 讨论

脑缺血模型对于脑缺血系统研究具有重大的意义，小鼠的选择可避免因大鼠体重差异过大，插线深度、插线粗细不一，术后出现无效模型的缺点，且随着研究的深入，基因层次的研究，需要建立一种完善的小鼠脑缺血模型。该研究在插入线栓位置、线径、进线深度、TTC染色等方面进行了优化改进，通过神经行为学评分，大脑中动脉血流监测，TTC染色测定梗死体积百分比，证明优化后模型的稳定性，从而建立一个重现性好、可控的不同品系小鼠局灶性脑缺血模型的通用方法。

研究中发现昆明小鼠对局灶性脑缺血损伤敏感且耐受性高，造模后24 h死亡率为零，观察1周，在不给予辅助喂养的前提下，小鼠可存活5 d；而C57BL/6小鼠造模24 h后死亡率较昆明小鼠高，对缺血敏感。吕青等[6]在对比研究C57BL/6和昆明小鼠脑缺血模型，也得出同样的结论。

早年制作脑缺血模型有使用开颅结扎电凝大脑中动脉法和颈内动脉注射血栓栓子闭塞大脑中动脉法，这些方法创伤极大，影响造模的稳定性。因此，线栓法成为脑缺血模型的经典方法。这对线栓本身有很高的要求，一方面是线栓的柔韧性，另一方面是线栓头端的稳固性和标准化。小鼠脑血管很脆弱，如果线栓过硬，在制备模型的过程中很容易将脑血管插穿，造成脑出血。甄毅岚等[7]在实验中采用石蜡包埋的线栓，这种线栓的缺点在于头端容易脱落，造成脑血管的其他部位的栓塞。因此采用同一直径（0.128 mm）的进口鱼线，柔软且有韧性，硅胶包被后头端平滑稳固，直径控制在（0.23±0.02） mm，使该模型更加规范化，更具有参考和实验的意义。

制作模型过程中，进线的深度具有决定性作用。吴晓光等[8]在实验中采用颈外进线法，插入深度从颈外动脉分叉处约10～12 mm，且模型过程中还需分离出颈内动脉及其颅外分支翼腭动脉，灼断翼腭动脉；葛海良等[9]造模时在翼腭动脉近起始处结扎，这无疑给小鼠造成过多的创伤，影响术后的恢复。本研究从颈总动脉进线，不需开颅，视野开阔、创伤极小，避免了开颅手术对脑组织的创伤和刺激及对颅内压的直接干扰和破坏作用，不影响缺血后脑水肿和梗死的病理变化的自然过程，更接近于临床病理条件；进线的深度在9 mm左右，可完全阻断大脑中动脉血供，研究中发现，当插线深度超过10 mm，极有可能将大脑中动脉插穿，造成脑出血，神经行为学评分结果也可达到3分，但会误导实验者，从而影响实验结果。

模型制作过程中，鼠肛温会明显降低，因此保持环境温度在25 ℃左右[10]。使用激光多普勒血流仪[11]动态监测小鼠大脑中动脉的局部脑血流变化，避免实验过程中由于人为因素出现过多无效模型。Bertrand Lapergue等[5]在造模过程中使用气体麻醉，该研究在现有的条件下调整液体麻醉剂的浓度，同样可以避免因麻醉过深引起的呼吸不畅。研究中小鼠断头取脑后直接置PBS冰水混合物中冷藏片刻于小鼠脑槽行冠状切片，大大提高了切片的速度和标准化，可减少梗死体积百分比的计算误差，对模型稳定性的评价更加客观。

改良的线栓法适用于不同品系小鼠大脑中动脉栓塞模型的制备，可为脑缺血的系统研究提供强有力的保障。研究中发现小鼠有时会出现向右旋转的现象，这可能在造模过程中损伤了脑部部分神经的缘故。脑缺血后存在一个半暗带区，但是该区变为缺血梗死区的时间很短，不会超过6 h[12]，这就间接的解释了缺血后，治疗窗时间在4 h内的原因。王媛等[13]在研究中发现，24 h是一个很重要的分界点，但再灌注24 h之后，梗死体积不再发生实质性的增加，因此在研究药物作用机制或药效时，可根据药物的具体半衰期等来制作不同时间点的脑缺血动物模型。

[参考文献]

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[3] Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84.

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[5] Bertrand Lapergue， Bao Quoc Dang， Jean-Philippe Desilles， et al. High-density lipoprotein-based therapy reduces the hemorrhagic complications associated with tissue plasminogen activator treatment in experimental stroke[J].Stroke，2013，44：699.

[6] 吕青，程彦磊，郭莲军.两种实验小鼠线栓法局灶性脑缺血模型的建立[C].天津：中国药理学会第十次全国学术会议，2009.

[7] 甄毅岚，王亚男，李晟，等.线栓法制备不同体重KM小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的建立及评价[J].中国实验动物学报，2013，21（2）：39.

[8] 吴晓光，颜勇，金宏伟.小鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的建立[J].承德医学院学报，2003，20（4）：282.

[9] 葛海良，Wen Ye，Guo-Yuan Yang，等.小鼠局灶性脑缺血模型中细胞间粘附分子-1表达升高[J].中国神经免疫学和神经病理学杂志，1999，3（6）：147.

[10] 汪萍，赵喜庆，吴浩，等.麻醉剂对脑缺血再灌注模型大鼠脑温变化的影响[J].辽宁中医药大学学报，2013，15（3）：12.

[11] Ye Liu， GuangHui Tang， YuHao Sun， et al. The protective role of Tongxinluo on blood-brain barrier after ischemia-reperfusion brain injury[J]. J Ethnopharmacol，2013，148：632.

[12] Liu F， Schafer D P， McCullough L D. TTC， Fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion[J]. J Neurosci Meth，2009，179（1）：1.

[13] 王媛，方莹莹，周小龙.大鼠大脑中动脉缺血再灌注后不同时间点梗死体积的变化[J].赣南医学院学报，2012，32（4）：489.

Build of focal cerebral ischemia model in different varieties of mice with

modification monofilament

JIA Qiang1，2， SHI Zuo-rong1， YANG Hong-jun2*

（1.School of Basic Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250300， China；

2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Objective： To establish a general method of focal cerebral ischemia model in different varieties of mice. Method： Each group of healthyKM and C57BL/6 mice were randomly divided into control group（n=10）and MCAO group（n=10）.The mice in MCAO group were applied in the preparation of the MCAO model by intraluminal occlusion using monofilament. Twenty-four hours after operation，the neurologic function was evaluated，middle cerebral artery blood flow was monitored and the infarction volume was calculated by TTC staining， to evaluate the reliability of the model. Result： In the MCAO group， the base value of the cerebral blood flow down of KM and C57BL/6 mice respectively was（81.65±4.59）%，（83.68±6.25） %. The neurological deficit score respectively was （2.30±0.82），（2.50±0.80）.TTC staining can clearly show the infarction area， and relatively stable， 24 hours of the survival rate of KM and C57BL/6 mice were 100% and 80% respectively. Conclusion： The key link is the optimization and improvement of monofilament，temperature， anesthesia and so on. The modified intraluminal occlusion of MCAO using monofilament is a kind of reliable and simple method to establish experimental cerebral ischemia model in mice.

[Key words]mice； middle cerebral artery occlusion； animal model； arterial thread insertion method

doi：10.4268/cjcmm20141732