运动性疲劳影响大鼠学习记忆功能和脑组织内Tau的表达

摘 要：目的：建立大鼠运动性疲劳模型，通过免疫组织化学法检测大鼠大脑皮层和海马CA1区内Tau蛋白的分布与表达，探讨其在运动性疲劳致大鼠学习记忆障碍发病机理中的作用。方法：成年雄性Wistar大鼠随机平均分为对照组、疲劳即刻组和疲劳恢复90 min组。疲劳即刻组和疲劳恢复90 min组大鼠进行十天游泳运动，每天运动至力竭，对照组大鼠不加干预。运用避暗穿梭实验检测大鼠学习记忆功能损伤情况，免疫组织化学法检测大脑皮层和海马CA1区Tau蛋白分布及表达，并测定Tau蛋白免疫阳性细胞的积分光密度值（IOD）。结果：疲劳即刻组和疲劳恢复90 min组大鼠学习记忆功能有不同程度损伤，其大脑皮层和海马CA1区Tau蛋白表达较对照组上调(P

关键词：运动性疲劳；学习；记忆；Tau

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2011)06-0054-03

Effects of Exercise-induced Fatigue on Rat Learning and Memory Ability and Expressions of Tau in the Brain

WANG Tai-lin

(Sports and Art Institute, North University of China, Taiyuan 030051, Shanxi China)

Abstract:Objective: Through establishing the rat model of exercise-induced fatigue，the paper detected the distribution and expression of Tau in the cerebral cortex and hippocampus CA1, and explored the role of Tau in fatigue-induced learning and memory disorder. Methods: Adult male SD rats were randomly divided into control group, 10-day fatigue group and recovery 90min group．Rats in 10-day fatigue group and recovery 90min group exercised to exhausted by swimming for 10 days，and those in control group didn’t exercise．Dark avoidance test was used to detect the changes of learning and memory ability．Immunohistochemistry was used to observe the distribution and expressions of Tau in the cerebral cortex and hippocampus．IOD of Tau- immunoreactive cells were also countered．Results: Rats with exercise-induced fatigue showed learning and memory disorder，and in the cerebral cortex and hippocampus CA1 of rats in the fatigue group，the expressions of Tau increased obviously compared with that of the control group(P

Key words: exercise-induced fatigue; learning; memory; Tau

Tau蛋白是一种微管结合蛋白，它的作用主要是稳定微管和维持神经功能。在对阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)的研究中发现Tau蛋白过度磷酸化和聚积，这可能是蛋白磷酸酯酶的活性受到抑制诱导的［1］，Guillozet等［2］认为大鼠海马Tau蛋白过度磷酸化与学习记忆能力的降低相关。Tau蛋白磷酸化程度是体内多种蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶脱磷酸化作用相互平衡的结果，Tau蛋白可以被体内的多种蛋白激酶磷酸化，这些蛋白激酶都是丝氨酸／苏氨酸激酶。随着现代竞技运动水平的提高，比赛的日益激烈，运动员在运动训练中和比赛中所承受的负荷越来越重，出现运动性疲劳的机率也就越来越大，过度的疲劳不仅影响训练效果，还可引起学习记忆能力的下降，有研究发现海马等脑区内Tau蛋白的变化与学习记忆功能的损伤相关［3］，但未协同地探讨脑组织各区域Tau蛋白的变化在某一应激损伤中的机制作用，尤其是运动性疲劳对大鼠大脑皮层和海马CA1区内Tau蛋白表达的影响未见报道。因此本研究采取十天游泳疲劳模型［4］，运用避暗穿梭实验检测大鼠学习记忆功能损伤情况，免疫组织化学技术检测运动性疲劳大鼠大脑皮层和海马CA1区内Tau蛋白分布与表达，为阐明运动性疲劳致大鼠学习记忆障碍的发病机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年雄性Wistar大鼠24只(购于山西省医科大学实验动物中心)，体重200～250 g，鼠龄(50±3)d，大鼠随机平均分为三组：安静对照组（CG）、疲劳即刻组(FG)和疲劳恢复90 min组(RG)。实验室适应性饲养3 d后进行以下实验。

1.2 运动性疲劳模型的建立 本实验的大鼠运动疲劳模型通过游泳运动方式建立，安静对照组大鼠不进行游泳训练，其它条件与实验组相同；实验组动物在建立运动疲劳模型之前需要先进行为期3天的适应性游泳训练，在120 cm×60 cm×80 cm的玻璃缸中进行，水深80 cm，水温(25±2)℃，每次训练20 min，每天1次。适应训练完成后开始建立10 d的正式游泳运动疲劳模型，前7 d每天只进行一次训练，持续时间是3 h；最后2 d每天要进行两次训练，两次训练之间有6 h的时间间隔。训练过程中，如果大鼠出现动作协调性显著下降并反复下沉时，将实验大鼠取出，给予3 min休息时间之后继续进行游泳训练，以保证每次训练总时间不低于3 h［4］。在运动疲劳模型建立期间要时刻观察并记录大鼠的运动能力及活动状态，并检测其体重的变化情况以更加准确地判断运动疲劳程度。

1.3 避暗穿梭实验 采用上海移数信息科技有限公司生产的避暗穿梭测试仪，该测试仪有明、暗两个箱子，箱与箱之间有隔板分开，在底部有一个孔洞可以使明暗箱互通。把大鼠放入明箱适应30 s后，打开隔板，大鼠会通过孔洞钻入暗箱。暗箱底部有带电钢棍，等大鼠身体全部钻入暗箱时立即施加电击，从而使其获得记忆。24 h后再将大鼠放入明箱，记录大鼠自放入明箱到第一次钻洞进入暗箱的时间，该时间被称为潜伏期，及进入暗箱的错误次数。检测时间以300 s为限，如果300 s内仍不进入暗箱者，视为该大鼠的记忆保持良好。

1.4 Tau蛋白的免疫组织化学实验 运动性疲劳后大鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉，经心脏快速灌注冲洗生理盐水约250 mL，再用4％多聚甲醛(PB配制，pH 7.4)约500 mL灌注冲洗固定，取全脑，在4％多聚甲醛中后固定20 h，脱水、包埋、切片，然后按照Tau蛋白免疫组织化学染色试剂盒说明进行免疫组化染色操作(SABC法)。

1.5 统计学处理 采用Olympus显微镜和计算机影像分析系统进行图像分析，从每只大鼠脑片中随机选取5张切片。在大脑皮层和海马CA1区各选5个视野，每个视野测量的像素量（即被测量面积）保持一致。分别对各组切片免疫组化染色照片中的神经元中Tau蛋白阳性表达进行定量分析，计算每个视野阳性细胞的积分光密度（iOD）值，并取5个视野的积分光密度之和。免疫组化实验获得的数据用SPSS15.0统计软件包进行One-Way Anova中的LSD检验，P

2 结 果

2.1 一般情况 运动疲劳模型建立10 d后，CG大鼠体重正常增长，活动状况良好；FG和RG大鼠多数出现精神萎靡，觅食及活动减少，毛发无光泽，体重增长缓慢的情况。

2.2 避暗穿梭实验 从表1可以看出，FG组大鼠避暗潜伏期缩短，错误次数增加，与CG组比较差异具有非常显著性（P

3 讨 论

在生理学研究中，避暗穿梭实验是最常用的研究鼠类学习记忆能力的一种行为学实验方法，原理在于大鼠嗜暗的习性，当把大鼠放在明暗对比明显的两个相通的箱室时，大鼠本能的会选择进入暗室，但是当大鼠进入暗室后以被动电击对其施加惩罚，让大鼠记住暗室是危险的，从而获得暂时不嗜暗的习性［5］。因此当大鼠在明箱适应30 s后，人为打开暗室通道，当大鼠身体全部进入暗箱时，对大鼠施加电击，大鼠受到电击后会立即逃避到安全的明箱。24 h后检测首次进入暗室的时间（潜伏期）和进入暗室的次数（错误次数），以评价大鼠的记忆能力。

本研究结果显示，运动性疲劳后大鼠的避暗潜伏期显著缩短（P

Tau蛋白是一种细胞内的微管相关蛋白，广泛存在于神经元轴突内，在促进微管的形成和保持微管的稳定性发挥着重要的作用。Tau蛋白基因中含有16个外显子，位于17号染色体长臂(17q21)上。由于mRNA的转录后剪切，成人脑中Tau蛋白存在6种异构体，由352-441个氨基酸组成［6］。已有研究［7］证明Tau蛋白的异常过度磷酸化在其聚积成NFTs的过程中和AD神经原纤维退行性病变中发挥了非常重要的作用。Tau蛋白微管结合能力的主要调节机制是在丝氨酸-苏氨酸指导下的磷酸化。在正常生理状态下，神经纤维Tau蛋白磷酸化水平很低。Tau蛋白为磷蛋白，其生物活性由其磷酸化的程度来调控，过度磷酸化可使Tau蛋白的稳定性以及与微管结合的能力降低。Tau蛋白过度磷酸化后从轴突微管上解离下来，在神经元聚集，最终沉积形成NFTs［8］。

Tau蛋白主要表达于中枢神经系统神经元的轴突，存在于少突角质细胞和星形胶质细胞内，在外周神经系统的神经元轴突也有表达，其磷酸化程度主要受体内多种蛋白激酶的磷酸化（PKA、PKC、CaMKⅡ、SAPK家族等）和蛋白磷酸酶脱磷酸化（CaN、PP2A、PP1等）共同调节，Tau蛋白与各种磷酸酶和激酶的结合不仅可以调节自身的磷酸化，也可以使这些磷酸转移酶定位到细胞内对应的底物，调节其它蛋白的磷酸化状态。过渡磷酸化后Tau蛋白生理功能发生了改变，可与正常微管相关蛋白MAPs相互竞争微管蛋白tubulin，影响到微管的形成，而且促进正常微管相关蛋白与微管分离，是微管崩解，并在脑中形成各种沉积物沉积在神经元内，引起神经元损伤，影响认知功能。过度磷酸化的Tau蛋白在细胞内聚集是许多神经变性的特征。目前的研究认为Tau蛋白的过度磷酸化与学习记忆能力的降低有关［9-11］，本研究发现运动性疲劳致大鼠学习记忆功能损伤，而Tau蛋白在大脑皮层和海马CA1区表达显著上调，这说明运动性疲劳致大鼠学习记忆功能损伤与Tau蛋白有关。研究证实大鼠在缺血再灌注损伤后脑内海马神经元的Tau蛋白量随着再灌注时间的延长越来越低，同时发现在Tau蛋白消失的区域神经元大多数已被破坏崩解，后来Zemlan等［12］研究发现急性颅脑损伤患者的脑脊液中Tau蛋白的浓度明显升高，进一步表明在脑损伤时，随着神经元的崩解，神经元支架蛋白Tau被降解而释放人脑脊液中。运动性疲劳也可引起脑损伤，因而推测运动性疲劳引起的大脑皮层和海马Tau蛋白表达上调可能与运动性疲劳引起的神经元损伤以及学习记忆功能损伤相关。

本研究取材部位为大脑皮层和海马CA1区，这两个部位是参与学习记忆功能的重要脑区。本研究显示，运动性疲劳后的大鼠的学习记忆能力显著下降，疲劳大鼠海马CA1区和大脑皮层内Tau蛋白的表达显著上调，恢复90min后Tau蛋白表达水平较疲劳即刻有所恢复，但是较安静组仍具有显著性差异，这些结果提示Tau表达的上调可能是其损害学习记忆的突触机制之一，且这种损害作用在短时间内是得不到很好的恢复的。

4 结 论

1）10 d游泳运动后，大鼠避暗潜伏期较安静对照组降低，错误次数增加，且差异均具有非常显著性（P

2）10 d游泳运动后，大鼠海马CA1区和大脑皮层内Tau蛋白的表达显著上调，表明Tau蛋白的过表达可能在运动性疲劳引起的学习记忆功能损伤中发挥作用。

参考文献：

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