补充海洋肽对大鼠骨骼肌bFGF及Desmin的作用

摘 要：目的：观察适应性训练、补充海洋肽以及大豆蛋白后骨骼肌bFGF 及desmin 含量的变化，研究运动训练、补充海洋肽以及大豆蛋白对运动性肌肉损伤和修复的影响。方法：以雄性SD大鼠72只，随机分为：安静组、运动组、运动+海洋肽组、运动+大豆蛋白组。进行6周适应性离心运动训练即-5°下坡间歇跑，跑速从20.0 m/min 递增至35.0 m/min，每次10～20 min，每周训练5 d，之后给予定量离心负荷，分别取运动后即刻、24 h和48 h不同时间处死、取股中间肌、测试。 结果：6周适应性训练可以增强desmin的适应能力。补充海洋肽组股中间肌desmin蛋白丢失较少。补充大豆蛋白组运动后即刻bFGF蛋白表达量显著性低于安静组，运动后48 h组bFGF蛋白表达量显著性高于运动后即刻组。结论：补充海洋肽能够更好的减少离心运动后骨架蛋白的丢失，促进运动后骨骼肌损伤的修复。

关键词：海洋肽；离心运动；bFGF；desmin

中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612(2011)06-0050-04

Effects of Marine Peptide Supplementation on bFGF and Desmin in Skeletal Muscle of Rat

YAO Yan1, WANG Qi-rong2, AN Jiang-hong3, YANG Rui-rui1, SHAO Jing2,GAO Hong2,ZHOU Yue1

(1.Beijing Sport University, Beijing 100084, China;2.National Institute of Sports Medicine Beijing, 100029, China;3. Beijing Institute of Sports Science,Beijing 100075, China)

Abstract:Objective: To investigate effect of training, the marine bioactive peptide and soybean protein supplementation on content changes of desmin and bFGF after eccentric exercise in rats. Methods: Male SD rats were randomly divided into non-exercise control group and three training groups: group of supplying marine bioactive peptide, group of supplying soybean protein and group of supplying water. In 6-wk training with five days/wk, the speed raised from 20.0m/min to 35.0m/min, and the grade was always -5°.In the seventh week, the tissues were collected separately at 0h, 24h and 48h after eccentric exercise. Results: 1.The desmin content decreased at 0h and began to rise at 48h after eccentric exercise.2.Supplying soybean protein could reduce the loss of desmin. 3.bFGF protein content increased earlier than desmin. Conclusion: Supplying soybean protein can repair desmin after eccentric exercise to some extent. Supplying marine bioactive peptide can reduce the loss of desmin better, but not by regulating bFGF.

Key words: marine bioactive peptide; eccentric exercise; bFGF; desmin

日益激烈的竞技体育对高水平运动员的体能要求越来越高，在训练科学化的同时，需要合理使用营养补剂提高运动员的训练效率，增强运动员运动能力。以往研究表明，补充大豆多肽有预防骨骼肌微损伤和促进损伤恢复的作用［1,2］。海洋生物种类众多，肽类物质来源广泛且含量较高。因此本研究探讨补充海洋肽在骨骼肌微细损伤的保护和修复方面的作用，为海洋肽应用于竞技体育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性SD大鼠72只，8周龄，体重160～200 g，随机分为：安静即刻组（S0）、安静24 h组（S1）、安静48 h组（S2），运动组即刻组（T0）、运动24 h组（T1）、运动48 h组（T2）、运动+大豆蛋白即刻组（P0）、运动+大豆蛋白24 h组（P1）、运动+大豆蛋白48 h组（P2）、运动+海洋肽即刻组（M0）、运动+海洋肽24 h组（M1）、运动+海洋肽48 h组（M2），每组6只大鼠（n=6），各组动物体重无显著性差异。大鼠饲养于北京大学医学部实验动物部二级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2006-0025。

1.2 研究方法1.2.1 训练方案 正式实验前3 d，进行5～10 min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10 m/min，坡度为0°。其后，对大鼠进行6周适应性离心训练，每周训练5 d，适应性离心训练方案参考Smolka等（2000）3，-5°下坡间歇跑，第1周20.0m/min，4次×5.0 min，次间歇2 min，第2周30.0 m/min，4次×2.5 min，次间歇1 min，第3周32.5究课题（2007-006）。

作者简介：姚燕，硕士，研究方向运动生理学。

m/min，6次×2.5 min，次间歇1 min，第4～6周35.0 m/min，6次×2.5 min，次间歇1 min。运动后30 min内进行灌胃，每日一次，分别补充大豆蛋白，海洋胶原肽，剂量按1.86 g/kg，单纯运动组与安静组灌等量双蒸水。海洋胶原肽中小分子肽类所占比例约90％左右，分子量在300-860 道尔顿之间；以甘氨酸，谷氨酸等含量较高。

6周适应性训练后，再进行一次性的定量负荷离心运动，负荷方案模型采用Armstrong(1983)［4］、田野运动模型［5］，-16°下坡跑台跑，跑速为26.8 m/min［6］，相当于最大摄氧量的80%～90%［7］，运动5 min，间歇1 min，共进行10组。给以少量声、光、电刺激，以激励大鼠运动。

1.2.2 标本取材 各组动物于运动后即刻、24 h和48 h不同时间用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量每100 g体重0.5 mL［8］。腹主动脉取血5～8 mL,离心，取血清置于-20℃保存待测。取右侧股中间肌做匀浆用。安静组动物不进行运动，其它处理同上。

1.3 实验方法

1.3.1 Western Blot 测定

1.3.1.1 肌肉匀浆 取出已研磨好的组织，用离心管准确称取0.3 g组织，按1：9比例加入裂解液（10 mM HEPES、10 mM KCl、0.1mM EGTA、0.1mM EDTA、0.5mM DTT、0.2mM PMSF，PH7.9）2.7mL，4℃振荡60 min；

1.3.1.2 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 将匀浆液4℃ 12 000 rpm离心20 min，收集上清液。上清液蛋白浓度用Bradford法测定，用裂解液调整蛋白至20 μg/10 μL，200 μL样品中加入5×样品缓冲液（（6.8 mL dd、1.2 mL 1M Tris-HCl pH7.8、5 mL glycerol、4 mL 10%SDS、2 mL 1% bromphenol blue、1 mL2-巯基乙醇）50 μL，沸水中煮5 min，分装待测。使用北京六一仪器厂的双垂直电泳槽DYCZ－24E，每个梳孔上样量10 μL, 电泳条件：凝胶厚度1 mm，分离胶浓度为12%，预染蛋白分子量标准(P7708V，New England Biolabs)。样品通过5%浓缩胶电压为60V,1 h，分离胶时电压为150V,4 h。考马斯亮兰R-250染液中染色20 min后用脱色，观察凝胶条带。

1.3.1.3 免疫印迹 将电泳后的凝胶置于转移缓冲液中(Tris 3.0 g、Glycine 14.5 g、Methanol 200 mL、10％SDS 1 mL)浸泡后，采用半干法将电泳凝胶中的蛋白转印到PVDF膜上。转印电流300 mA进行电转移，时间大约130 min。

转印后PVDF膜，用3%BSA溶液中，振摇封闭1 h；用3%BSA稀释一抗（Desmin 1：1000，编号：D1033，Sigma；β-actin 1：2000，编号：sc-477778，Santa Cruz；bFGF抗体1：500，编号：sc-79，Santa Cruz），4℃振摇过夜，取出PVDF膜，洗膜3次，每次10min；将膜放入3%BSA稀释的二抗溶液（辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG浓度：1：2000，编号sc-2005，Santa Cruz； 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG浓度：1：7000，编号sc-2004,Santa Cruz），4℃振摇1 h，PBST洗膜3次后，常规显影定影。

1.3.1.4 图像分析 将晾干的胶片放置在YLN－2000的暗室内，用凝胶影像分析系统拍摄照片。照片拍摄后用ImageJ处理条带，用ImageQuant TL软件计算出条带的Integrated Density值。

1.4 数据统计方法 使用统计学分析软件SPSS 13.0 for windows 完成数据统计学处理，所有数据以平均值±标准差（X±SD）表示。组间采用单因素方差分析（One way ANOVA），显著性差异定为P

2 结 果

由表1可见，在6周的训练过程中，大鼠处于生长期，各组大鼠的体重均随训练的周数增加而增加。同一周次内，除第1周单纯运动组外，其余各组体重均显著性低于安静组(P

如图1和表2显示，单纯运动组大鼠运动后即刻股中间肌desmin蛋白表达量低于安静组，运动后24 h继续下降，运动后48 h蛋白表达量开始升高。补充大豆蛋白组大鼠运动后即刻股中间肌desmin蛋白表达量低于安静组，运动后24 h表达量显著性低于安静组（P

运动后即刻，补充海洋肽组bFGF蛋白表达量最高，补充大豆蛋白组最低， 显著性低于安静组(P

3 分析讨论

3.1 适应性训练过程中大鼠体重的变化 与Smolka等（2000）［3］研究以及周越博士论文研究结果相似。在适应性训练过程中，单纯运动组大鼠体重显著低于其同周次的安静对照组。说明大强度的训练对大鼠的生长有一定的抑制作用，这可以与能量消耗增加，及脂肪堆积减少有关。补充大豆蛋白和补充海洋肽组与单纯运动组之间无明显差异，这说明补充大豆蛋白或海洋肽并不会导致体重的增加，可能成为有效的营养活化剂。

3.2 适应性训练后定量大负荷下desmin 及bFGF 蛋白含量的变化 离心运动后导致骨骼肌损伤后，会激活位于细胞肌膜和基底膜之间的卫星细胞，卫星细胞增殖融合最终形成新的肌纤维来代替损伤的肌纤维。Desmin是肌生成中第一个出现的肌肉特异性蛋白，它的合成起始于肌小管融合时，认为是辨别再生肌纤维的一个有用的诊断工具［9］。以往的研究表明［9-13］，在动物模型中，一次性离心运动后，desmin会出现急剧丢失出现在运动后5 min～7 d。而desmin明显增加发生在运动后3～7 d，提示了此蛋白的合成是离心运动后肌肉重建过程的一部分。以往报道显示，无论是动物模型还是人体模型中，desmin的适应能力很快［9-16］，这是因为功能完整的骨架结构是增加肌肉能力的前提。Baldi JC等人研究，给予兔子3周低强度刺激，可以观察到第1和2周时，desmin会出现增加，但是第3周时则不再增加［17］。本研究中单纯运动组大鼠运动后即刻股中间肌desmin蛋白表达量略低于安静组，运动后24 h继续下降，直到运动后48 h蛋白表达量开始升高，但均无显著性差异，这可能与6周适应性训练相关，desmin的适应能力增强。

bFGF是一种有效的促有丝分裂剂，具有促进细胞增殖的作用。作为一种自分泌因子， bFGF经骨骼肌纤维产生后又常储存于骨骼肌纤维内膜［18］。尽管在大鼠骨骼肌发育的一生中均有bFGF蛋白表达，但这种蛋白质的一个突出特征是产生后便与肝素盐结合，以无活性的方式存在于骨骼肌纤维间基质中［18］。

本研究中，单纯运动组大鼠股中间肌bFGF蛋白表达量运动后即刻下降，24 h上升，运动后48 h继续上升，但均无显著性差异。这可能是因为骨骼肌损伤后，在较强炎症反应条件下，淋巴细胞肝素溶解酶能溶解胞外基质中的肝素，进而引起储存于胞外基质中bFGF释放，一部分受激活而发挥生理作用，另一部分失去肝素保护后被蛋白酶灭活，因此出现bFGF表达量的变化。

3.3 补充海洋肽或大豆蛋白对适应性训练后定量大负荷下desmin及bFGF 蛋白含量的影响 本研究中，补充大豆蛋白组大鼠运动后即刻股中间肌desmin蛋白表达量低于安静组，运动后24 h表达量显著性低于安静组（P

补充大豆蛋白组大鼠运动后即刻desmin蛋白表达量低于安静组，而bFGF蛋白表达量显著性低于安静组(P

补充大豆蛋白组大鼠desmin蛋白表达量运动后24 h降低到最低点（P

补充海洋肽组大鼠运动后即刻股中间肌desmin蛋白表达量低于安静组，运动后24 h继续下降，运动后48 h蛋白表达量升高。运动后即刻，24 h，48 h时补充海洋肽组desmin蛋白表达量均高于其它两组，但无显著性差异。说明补充海洋肽组股中间肌desmin蛋白丢失较少，这可能与小肽的吸收利用较好有关。 小肽的吸收与氨基酸相互独立的吸收机制，有助于减轻由于游离氨基酸相互竟争共同吸收位点而产生的吸收抑制，组织直接利用小肽比利用游离氨基酸更有效。补充活性肽［21］可能通过抑制Calpain 活性，从而使Desmin 免受Calpain 的水解作用， 从而保护了肌节的结构，减轻了运动性骨骼肌微细损伤的发生。另外活性肽还可以刺激生长激素、胰岛素等的释放，抑制分解激素如皮质醇的分泌，起到促进骨骼肌蛋白质合成和抑制蛋白质分解的双重作用。本研究中补充海洋肽组股中间肌desmin蛋白丢失较少，但这种desmin的丢失减少是由于desmin的降解减弱或/和其合成重建增加导致的还有待于进一步的研究。

4 结 论

补充海洋肽能够更好的减少离心运动后骨架蛋白的丢失，促进运动后骨骼肌损伤的修复。

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