大学化学热水法提取鱼鳞明胶实验分析

摘要为了丰富农科大学有机化学实验内容，本文介绍了一种热水法较短时间从鱼鳞中提取明胶的技术，并用比色法对提取效率进行评价。结果表明，该方法适合推广为农科大学有机化学或者综合化学实验。

关键词鱼鳞;明胶;热水提取法;农科大学;化学实验

我国淡水鱼产量丰富，居世界首位。每年淡水鱼加工业的废弃物总量达200万t以_卜，其中鱼鳞约占150Io。这些副产物的加工和利用程度很低，除少部分用于制造伺料鱼粉外，其余都被废弃，不仅造成了资源的极大浪费，还严重污染了环境。回收利用鱼鳞不仅能实现环境保护，还可以提高广大研究者的研究兴趣、激发学生的探索热情。现有的大学化学实验教材中，有一些实验涉及到天然产物的提取，但多是从植物体中提取有机物，如从茶叶中提取咖啡因、从植物中提取叶绿素、从果皮中提取果胶等，从动物体中提取有机物的实验很少涉及。蛋白质是一种重要的有机化合物，是《有机化学》和《生物化学》等教材中的一章重要内容。本研究可以作为大学有机化学实验，尤其是农科类有机化学实验以及大学化学综合实验的补充内容，通过该实验可以使学生熟悉蛋白质、明胶等物质的区别，掌握鱼鳞中明胶的提取方法和轻脯氨酸法分析明胶含量的方法，对学生掌握蛋白质相关内容、分析蛋白质含量有十分重要的意义。

1实验目的

①了解鱼鳞的组成成分。②了解胶原蛋白的结构及检测方法，了解胶原蛋白转变为明胶的过程。③掌握万能粉碎机、分光光度仪等仪器的使用方法。④掌握比色法测定轻脯氨酸的方法。

2实验原理

2.1鱼鳞成分介绍鱼鳞是鱼体与外界接触的边缘组织，含有丰富的蛋白质和各种矿物质，起到保护鱼体免遭损害的作用，是鱼类皮肤经长期进化而形成的衍生物。鱼鳞主要由蛋白质和轻基磷灰石组成，其中蛋白质占500Io}700Io，主要为胶原蛋白和少量的角蛋白、球蛋白、粘蛋白等f}-31完整结构的胶原蛋白是一种纤维蛋白，相对分子质量为3000kDa，最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条左手螺旋构型的cx多肤链组成。3条肤链相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构。它不溶于冷水和温水，也不溶于酸、碱或盐的稀溶液中。胶原蛋白局部水解后转变为明胶f}-}l角蛋白是硬蛋白的一种，具有纤维结构，在水、盐类溶液及稀的酸、碱溶液中完全不溶解。球蛋白、粘蛋白等杂蛋白含量少，易溶。易在鱼鳞的反复清洗和前处理过程被除去。灰分物质主要由大量的轻基磷灰石[Ca(OH)=(POQ)}]和少量的无机盐组成，这些盐类可用盐酸处理，使之变成可溶性盐除去。2.2明胶明胶已经失去了生物了舌h}，是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物，主要有以下2个转变过程。第一过程为热变性，约40℃时发生。该过程使氢键或静电性连接断裂，相互缠绕的链彼此松开进人溶液，引起胶原螺旋解体，形成许多无规线团。但是因为交联的稳定因素在起作用，单靠此过程还不足以使成熟的胶原转化为明胶。第二过程是共价交联的水解。交联键断裂形成明胶碎片(分子)，才能制得明胶。实际_卜，断裂键是随机过程，由所处条件决定，与pH值及温度直接相关，故明胶不是均一的蛋白质，而是一种混合物。因此，可以通过各种方式除去鱼鳞中的有机和无机杂质，最终提取得到产物明胶。除杂反应式(灰分);Ca,o(POa)e(OH)=+20HCl=10CaCI=+6H3P04+2H=02.3明胶测定原理轻脯氨酸是一种已有氨基酸，为胶原蛋白所特有，含量约为90I0将明胶水解之后测定其中的轻脯氨酸，再乘以相应系数即得到明胶含量。本实验中用比色法测定溶液中轻脯氨酸的含量。首先用氯胺T氧化轻脯氨酸生成含叶口各环的物质，然后以高氯酸溶液除去多余的氯胺T:然后加人对二甲基氨基苯甲醛溶液作为显色剂，生成红色化合物。用紫外一可见分光光度计测定560nm处溶液吸光度，从而得到轻脯氨酸的含量。

3试剂与仪器

试剂:盐酸、氢氧化钠、双缩昵试剂(自制)、柠檬酸钠、冰醋酸、柠檬酸、氯胺T、乙二醇独甲醚、无水乙醇、浓硫酸、对二甲基氨基苯甲醛、高氯酸,L-轻脯氨酸标准品(990}0等。以_卜药品除标注外均为分析纯。仪器:烧杯、试管、玻璃棒、容量瓶、移液管、量筒、电子天平DT200、分析天平、组织粉碎机、万能粉碎机WF100、分光光度仪WFJ7200、比色皿、水泵、布氏漏斗、吸滤瓶、电磁搅拌器、水浴锅等。

4实验步骤

4.1实验过程4.1.1原料前处理。对鱼鳞原料进行清洗并晾干。称取适量鱼鳞，经组织粉碎机简单除杂后，再用万能粉碎机处理，粉碎成棉絮状f}-}l，称取79放人烧杯中。4.1.2除杂过程。加人。.4mol/L盐酸溶液150mL[料液比}}:mL)为1:15]，电磁搅拌浸泡处理。2h后抽滤，用去离子水洗涤滤饼至pH值为中性。将抽滤后固体放人烧杯中，再加人。.1mol/L氢氧化钠溶液150mL[料液比(}}:mL)为1:15],电磁搅拌浸泡处理。15min后抽滤，用去离子水洗涤滤饼至pH值为中h}}4.1.3产物提取。向固体物质中加人150mL去离子水[料液比(g/mL)为1:15],60℃水浴加热2.5h，趁热滤去固体物质得明胶溶液，用容量瓶将液体定容至100mL4.2含量检测对明胶溶液进行比色法检测，测定其中明胶含量!io-i3}(1)轻脯氨酸标准储存液配制:准确称取L-轻脯氨酸标准品(990Io)100mg，加人。.01mol/L盐酸中溶解，然后定容至100mL，置于冰箱中保存，备用。(2)轻脯氨酸标准工作液配制:吸取_卜述储存液10mL于容量瓶中，蒸馏水定容至100mL(临用前配)，质量浓度为100mg/L}(3)样品水解液配制:取样品5mL放人A号烧杯，向其中加人6mol/L氢氧化钠溶液25mL，作为实验组;取去离子水5mL放人B号烧杯中，加6mol/L氢氧化钠溶液25mL作为对照组。静置20min后用双缩昵试剂定性检测溶液。若A号烧杯无变色反应，就从A号烧杯中吸取SmL溶液调pH值约为7，定容至1OOmL容量瓶中。(4)标准曲线绘制:分别吸取轻脯氨酸标准工作液0.5、1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5mL，用蒸馏水稀释，定容至100mL}分别取_卜述不同浓度梯度的标准液和样品水解液1mL于试管中，加人柠檬酸缓冲液1mL和0.05mol/L氯胺T溶液1mL，室温(25℃)氧化10min。然后加人高氯酸1mL，放置10min。最后加人对二甲基氨基苯甲醛显色试剂1mL，在65℃水浴显色10min。冷却后，以蒸馏水为空白对照，测定560nm处吸光度。以轻脯氨酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，见图1，求出回归方程。

5结果与讨论

5.1产率计算公式在测定过程中，相当于将样品稀释了12。倍，所以产率训一算式为:其中，。为样品中轻脯氨酸的浓度，n为稀释倍数，v为产品原液总体积，11.1为转换系数，m为鱼鳞碎屑质量。5.2轻脯氨酸标准曲线根据测定结果，轻脯氨酸标准曲线为y=0.0666、十0.07375.3测量结果及产率计算A号样品的吸光度为。.126将数据代人轻脯氨酸标准曲线，得到对应浓度后再计算产率得1.490Io

6注意事项

6.1除杂过程除杂时，应用电磁搅拌机搅拌，以增加反应速率。而且忌在除杂时加热，否则目标产物会迅速流失，大大降低产量。另外，酸碱液浓度不应太高，处理时间不能太长，否则同样会造成产物的大量溶解流失。6.2抽滤过程本实验中，所有的固液分离步骤均采用抽滤法，快速省力。但一定要注意在抽滤完成后趁i转移固体，否则固体物质粘滞在滤纸_卜不易转移，会造成较大的实验误差。明胶溶液抽滤时，一定要趁热抽滤，否则低温下溶液将转变为凝胶状，导致抽滤无法进行。6.3轻脯氨酸含量测定配制标准溶液时，一定要估算待测溶液浓度，使待测溶液浓度处于标准溶液浓度梯度之中，否则将有较大误差。

7结语

该研究内容是将北京农学院的大学生科研项目和基础化学实验课程体系改革教学研究项目相融合的范例。项目自立项以来，在培养学生科研兴趣、熟悉科研流程，以及如何将科研成果与基础化学实验改革相结合方面做了许多有益的尝试，本文介绍的大学生科研项目的成果可以作为农科院校学生有机综合实验的内容，为丰富农科院校基础实验提供参考。

作者：李志 谢维威 杨袜魏 朝俊贾 临芳串 单位：北京农学院生物科学与工程学院