植物分子标记研究进展

摘要 主要介绍了以RFLP、SSR及SNP为代表的3代植物分子标记的基本原理、特征及应用范围，并针对不同植物分子标记的发展前景进行了阐述。

关键词 植物分子标记；原理；应用；进展

中图分类号 Q7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）15-0047-02

Research Progress of Plant Molecular Markers

HAN Lei SUN Xin

（Department of Life Science of Hengshui University，Hengshui Hebei 053000）

Abstract Basic principle，characteristic and application scope of plant molecular markers with the representative of RFLP，SSR and SNP were introduced，the development prospects of various plant molecular markers were described.

Key words plant molecular markers；principle；application；progress

分子标记（Molecular Markers），是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。它是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的遗传标记方法。随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术已有数十种，分子标记的方法越来越表现出其优越性。目前，在物种亲缘关系鉴别、基因组作图、植物遗传育种等方面分子标记已得到了广泛应用。

1 第1代分子标记

1.1 限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）

RFLP是以DNA-DNA杂交为基础的第1代分子标记，由于不同个体等位基因之间碱基的替换、插入、缺失或重复等变化，造成了限制性内切酶的识别和酶切发生改变，从而造成基因型之间酶切片段长度的差异，可反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况。RFLP在基因组中以低拷贝编码序列为主，存在稳定，具有共显性的特点。但其操作工序比较复杂，对DNA的需求量也比较大，不仅成本高，而且检测的周期较长，在大规模的分子育种中不适用。

余四斌等利用RFLP对生产上广泛应用的优良杂交组合汕优63的分离群体进行分析，很好地定位了32个控制产量及其构成性状的QTLs[1]。孙传青等利用RFLP分子标记研究了中国、南亚、东南亚普通野生稻与栽培稻和粕粳之间的遗传分化关系，研究表明粕粳演化是多途径的，粕粳分化是栽培稻核DNA遗传分化的主流[2]。

1.2 随机扩增多态性DNA标记（Random Amplified Poly-morphic DNA，RAPD）

RAPD技术是建立在PCR 基础之上的。它应用了PCR的反应原理，以基因组DNA为模板，在热稳定的DNA 聚合酶作用下，以单个随机核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，进行PCR 扩增。扩增产物经过电泳的分离、染色后，采用紫外透视仪进行检测。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。与RFLP相比，RAPD需要的模板量较少、灵敏度高、操作简便、快捷的特点，在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。但易受试验条件影响，重复性差，产率低[3]。胡保忠等利用RAPD分子标记用43个随机引物对11个紫花苜蓿进行扩增，共检出440条扩增片段，对紫花苜蓿进行了很好的聚类分析[4]。

1.3 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Pol-ymorphism，AFLP）

AFLP是基于PCR的一种选择性扩增特异片段的方法。对不同物种的基因组DNA进行利用，经过限制性内切酶的酶切后，可以得到大小不同的分子片段，将酶切片段与相应的接头连接，以接头序列及邻近内切酶的识别位点作为引物的结合点，采用含有1～3个选择性碱基的不同引物进行DNA扩增，不同选择性碱基的数目、种类和顺序决定了扩增片段的特异性。扩增产物经放射性同位素标记、电泳分离，最终根据凝胶上DNA条带的有无来检验其多态性。它兼具了RFLP的可靠性和RAPD的方便性等优点，但它对DNA的纯度要求较高，操作繁琐。黄想安等利用AFLP技术表明石蒜属具有非常高的种间遗传多样性，为石蒜物种的分类鉴定提供一个很有效的依据[5]。

2 第2代分子标记

主要包括简单序列重复（Simple Sequence Repeat，SSR）。SSR也称微卫星DNA，不同的重复碱基对串联数目决定了其高度多态性。它根据微卫星两端互补序列进行引物的设计，然后通过PCR进行扩增，由于不同的核心序列串联重复数目，扩增出的PCR产物的长度也有所不同，通过电泳技术对扩增的产物进行分离，结合片段的大小决定基因型，并对等位基因的频率进行计算。在真核生物中可根据其两端的高度保守序列，设计双引物进行PCR扩增，深入揭示其多态性[6]。SSR一般可检测1个单一的多等位基因位点，其位点呈共显性遗传，同时检测所需DNA量较少。Han等利用SSR标记构建了第1张含有小豆SSR标记的分子遗传图谱[7]。

3 第3代分子标记

主要包括单苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）。SNP标记是基于DNA 芯片技术的第3代分子标记，包括单个碱基的插入、缺失等[8]，主要是由于单核苷酸发生了突变而造成。SNP的位点广、遗传稳定性较好，检测迅速，适合于数量较大的检测分析。Xu等通过检测水稻亲本9311，检测到了768万个SNP位点，绘制了1张高密度的Bin图谱。通过Bin图谱，定位1个重要的QTL[9]。朱磊利用SNP标记精细定位水稻苯达松敏感致死基因，得出该基因位于第3染色体上0.4 cM范围内，且4个SNP标记与其共分离[10]。

4 新型分子标记

4.1 多样性芯片技术（Diversity Arrays Technology，DArT）

DArT技术是2001年发明的一种基于芯片杂交技术的新型分子标记技术。其主要依靠不同来源的基因组DNA定限制性内切酶位点的分布不同，从而产生多态性。Heller-Uszynska等首次在甘蔗属内采用了该技术，对其遗传关系进行了分析，且构建了遗传图谱，结果表明甘蔗的原始种和栽培种之间遗传差异大，且大多数DArT标记与孟德尔分离规律相符合[11]。高轶静等利用7份不同种属的甘蔗材料为样本建立DArT标记体系，结果表明其遗传相似性分析结果与材料预期的亲缘关系密切程度相一致[12]。

4.2 靶位区域扩增多态性（Target Region Amplified Poly-morphism，TRAP）

TRAP是一种在2003年被提出的基于PCR的新型分子标记[13]。该技术是基于已知的cDNA或EST序列信息，主要在遗传图谱的构建、重要性状的标记等方面应用。Hu等应用TRAP技术扩增出菠菜中59个TRAP多态性标记[14]。Chen等采用了TRAP标记对小麦比较基因组图进行了绘制，并证明Qfhs.ndsu-3AS与Qfhs.ndsu-3BS不同源[15]。

4.3 限制性内切酶位点标签（Restriction-Site Associated DNA，RAD）

RAD标记技术是2007年开发的一种应用于非模式生物的分子标记，目前已应用于寻找DNA多态性，鉴别SNP，基因测序，构建遗传图谱，定位目的性状基因，研究生物多样性等方面。Chutimanitsakun等利用已知序列的RAD标记绘制出了高质量的遗传连锁图谱，验证了对于单个基因位点的检测和QTLs[16]。Barchi等利用RAD测序，测定茄子超过10 000个SNP位点，1 600个多态性位点和1 800个假定的SSR位点，对于构建茄子的遗传图谱有重要意义[17]。

5 结语

分子标记一直处于不断的发展之中，不同分子标记各有优缺点，有不同的适应对象。相信随着分子生物学、生物信息学、基因芯片等不断的发展及与分子标记的相互融合，将出现更加具体的、目的性更强的、更简单的分子标记。分子标记在人们的研究、生产等方面将有更加广阔的应用前景。

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