应用SELDI技术建立尿毒症患者筛选血清蛋白质指纹图谱模型

【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)12－0030－01

【摘要】目的:建立尿毒症患者筛选血清蛋白质指纹图谱模型。方法:用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)及CM10蛋白芯片获得尿毒症患者和健康者血清的蛋白质指纹图谱,用计算机软件进行比较分析,建立尿毒症的筛选模型。结果：尿毒症患者与健康对照组血清蛋白质指纹图谱之间有5个标志蛋白(6946Da, 6543Da, 11743Da, 6076Da, 6749Da)在尿毒症患者血清中高表达，1个标志蛋白(8703Da)在尿毒症患者血清中低表达。SELDI-TOF-MS技术的特异性(38/40，95%)，敏感度(36/40， 90%). 分析系统筛选出6543Da、6076Da、8703Da、11743Da标志蛋白建立尿毒症的诊断模型。结论：建立的血清蛋白质指纹图谱模型能够区分尿毒症患者与健康者, SELDI-TOF-MS在尿毒症的诊断及特异性蛋白质生物标志分子的筛选等方面具有一定价值。

【关健词】表面增强激光解析电离飞行时间质谱; 蛋白芯片; 尿毒症

尿毒症是肾功能衰竭的最严重阶段，病情严重，死亡率高。在我国的发病率每年每百万人口中新发生的尿毒症患者约占1%，其中80％为青壮年，严重影响了人们的健康和生命安全。肾衰早期，往往无临床症状，而仅表现为基础疾病的症状，因此早期发现、早期治疗是预防进入尿毒症期的最有效方法。我们利用美国Ciphergen 公司生产的表面增强激光解吸离子化时间飞行质谱（surface enhanced laser desorption/ionization）技术对尿毒症患者和健康志愿者血清中的蛋白质进行对比分析, 采用生物信息学方法建立可作为尿毒症诊断标志的蛋白质组合样式, 寻求可用于临床尿毒症早期诊断的特异性生物标记物。

1 材料与方法

1.1 材料 所有尿毒症患者血清样品均为2004-08至2006-06台州市立医院的门、住院患者, 40例, 其中男30例, 年龄35-60岁, 女10例, 年龄45-64岁, 符合尿毒症诊断标准［1］，对照样品来自经健康查体正常的志愿者40例, 其中男30例, 年龄40-68岁; 女10例, 年龄40-65岁。在10 ml血清分离管中全血采集,于-4℃ 4000 r/min离心10 min. 取30 μl血清分装在0.5 ml离心管中, 于-70℃冰箱保存. 美国赛弗吉公司的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-time OF Flight-Mass Spectrometry, SELDI-TOF-MS)及该公司配套CM10（弱阳离子交换）芯片. 主要试剂: 尿素、乙腈、三氟乙酸等均购自Sigma公司, SPA(Sinapinic Acid) 购自Ciphergen Biosystems公司. U9缓冲液(9 mol/L Urea, 20 g/L CHAPS, 10 g/L DTT, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 9.0 ), U1缓冲液(用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液9倍稀释U9缓冲液), CM10缓冲液(100 mmol/L 乙酸钠pH4.0)。

1.2 方法 血清经冰浴融化后4℃20000r/min离心10min.取20μl血清，加30μl U9缓冲液，4℃振摇20min，再加100μl U1缓冲液，4℃震荡30min.每个芯池中加150μl CM10缓冲液，振荡孵育5min 2次.从上述蛋白变性后的血清样品中取50μl，加200μl CM10缓冲液稀释，加至CM10芯片的Bioprocessor中，振荡60min，甩去血清标本，每孔加150μl CM10缓冲液，振荡孵育5min 2次，最后芯片用20mmol/L HEPES（Ph7.4）淋洗，晾干芯片.芯片每孔分2次加SPA 0.5μl，两次之间自然晾干。质谱仪参数设定为激光强度220,灵敏度7,优化范围800-20000质荷比(m/z)。每条芯片取1点用同一正常人血清作内参照，芯片间CV≤10%.检测前用ALL-IN-ONE多肽标准芯片校正，系统质量偏差≤0.1%.原始数据先以Proteinchip 3.0软件校正。

统计学处理 采用Ciphergen ProteinChip软件和BioMarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据按数据挖掘要求进行处理，用Biomarker Wizard Software3.1软件和Biomarker Patterns Software4.0.1软件对数据进行分组及相关性分析，比较两组之间蛋白质峰强度时, P

2 结果

对40例尿毒症患者和40例健康者样本进行血清蛋白质谱分析, 共得到141个蛋白质峰，共有45个蛋白质峰具有显著性差异（P

表1 尿毒症的六个特征峰的表达值

图1 尿毒症患者与健康者血清蛋白质指纹图谱

图2 尿毒症与健康者6076Da、6543Da、8703Da、11743Da处血清蛋白质谱图

图3 尿毒症与健康者6946Da、6749Da处血清蛋白质谱图

3 讨论

蛋白质组学研究的主要技术是双向电泳和质谱等, 目前双向电泳的技术虽然很成熟, 但它固有的缺点限制了双向电泳直接用于临床检测。SELDI蛋白芯片技术根据层析技术和质谱技术发展而来,其表面可结合特定的蛋白质， 该技术不会破坏所测定的蛋白质， 检测简便,特异性和敏感性高, 且可将传统方法检测不到的蛋白和多肽检出。对照分析患者和健康者的质谱图, 可发现和捕获新的特异性疾病相关蛋白。目前, 用SELDI蛋白芯片技术获得有意义成果的数量已经日益升高［2-4］， 尤其在一些癌症的诊断上, 如前列腺癌［5］、卵巢癌［6］、乳腺癌［7］的诊断上。 从血清中寻求特异性生物标记物用于尿毒症等诊断是目前临床急需解决的难题。 本研究是采用SELDI-TOF-MS 技术通过比较蛋白质组学研究，发现一些敏感性和特异性均较高, 且易于临床检测的新的生物标志物。 我们采用CM10蛋白质芯片对40 例尿毒症患者和40例健康者的血清样本进行了蛋白质谱分析, 通过Biomarker Wizard 分析显示在尿毒症与健康志愿者两组之间发现有5个标志蛋白(6946Da, 6543Da, 11743Da, 6076Da, 6749Da)在尿毒症患者血清中高表达，1个标志蛋白(8703.4Da)在尿毒症患者血清中低表达。以6543Da、6076Da、8703Da、11743Da这四个蛋白质建立模型可用于区分尿毒症患者与健康志愿者. 所得结果敏感性为90%, 特异性为95%。通过这几个峰的鉴别, 其结果准确性高, 有利于患者早期筛查、早发现、早治疗。

本实验将SELDI技术应用于分析尿毒症患者血清差异表达蛋白, 发现了几种新的尿毒症相关蛋白质,对尿毒症的早期诊断有一定的价值。 对于SELDI技术来说, 每个M/Z值对应的可能是很多分子量相近的多肽,因此不能对体液中的蛋白质进行鉴定［8］, 故该蛋白质的结构、功能及是否是已知蛋白等均不清楚, 需要在下一步的实验中予以解决。 通过质谱技术, 分析该蛋白质的多肽片段得到其肽指纹图, 在蛋白质数据库中搜寻与之匹配的蛋白质。

参考文献

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［5］ Adam BL,Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, Semmes OJ, Schellhammer PF, Yasui Y, Feng Z, Wright GL Jr. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men［J］. Cancer Res 2002，62: 3609-3614.

［6］ Bandera CA, Ye B, Mok SC. New technologies for the identification of markers for early detection of ovarian cancer［J］. Curr Opin Obstet Gynecol,2003,15:51-55.

［7］ Paweletz CP, Trock B, Pennanen M, Tsangaris T, Magnant C, Liotta LA, Petricoin EF 3rd. Proteomic patterns of nipple aspirate fluids obtained by SELDI-TOF: potential for new biomarkers to aid in the diagnosis of breast cancer［J］. Dis Markers,2001,17:301-307.

［8］ Boguski MS, McIntosh MW.Biomedical informatics for proteomics［J］. Nature, 2003，422:233-237.

作者单位：318000 浙江省台州市椒江区三甲街道社区卫生服务中心