纤维素酶—乙醇法提取苦丁茶中总黄酮

摘要：采用纤维素酶酶解预处理与乙醇浸提法相结合从苦丁茶中提取总黄酮。通过单因素试验考察酶用量、酶解时间、酶解温度、pH、乙醇体积分数和乙醇用量对总黄酮提取率的影响，优化提取工艺条件。结果表明，优化的提取工艺条件为0.5 g苦丁茶粉末中加入纤维素酶1.0 mg、酶解时间2.0 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 4.5、体积分数60%的乙醇用量35 mL，最佳提取工艺条件下苦丁茶中总黄酮提取率达7.80%。

关键词：苦丁茶；总黄酮；纤维素酶—乙醇法；提取工艺

中图分类号：S571.1；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5445-03

Extraction of Total Flavonoids from the Leaves of Ilex latifolia by Cellulase-Ethanol Method

HUANG Jing

（Chemical Engineering College， Qinghai University， Xining 810016， China）

Abstract： Total flavonoids were extracted from leaves of Ilex latifolia （Kuding tea） by cellulase-ethanol method. The effects of cellulose dose， enzymolysis time， temperature， pH， volume fraction of ethanol， and dose of ethanol on yield of total flavonoids were studied by single factor tests so as to optimize the extraction conditions. The results showed that the optimum extraction conditions were obtained as follows， dose of cellulose enzyme， 1.0 mg per 5.0 g Kuding tea flour； enzymolysis time， 2.0 h； enzymolysis temperature， 55 ℃； pH， 4.5； volume fraction of ethanol， 60%； dose of ethanol， 35 mL per 5.0 g Kuding tea flour. The yield of flavonoids was up to 7.80% under these conditions.

Key words： leaves of Ilex latifolia（Kuding tea）； total flavonoids； cellulase-ethanol method； extraction technology

黄酮类化合物是广泛分布于各种植物的一类次生代谢产物，是药用植物的主要活性成分之一，其主要生理活性表现在对心血管系统的作用、抗肝毒作用、抗炎作用、雌性激素作用、抗菌及抗病毒作用、泻下作用和解痉作用等。苦丁茶是中国现代茶饮料植物中的奇葩，其黄酮含量远高于其他茶叶。目前，苦丁茶中总黄酮化合物的提取方法主要包括有机溶剂提取法[1-3]、超声波法[4-7]等。苦丁茶中总黄酮类化合物几乎被以纤维素为主的细胞壁所包围，传统的提取方法由于无法使包围黄酮类化合物的细胞壁破裂，黄酮类化合物向溶剂主体的扩散受阻，致使提取效果受到很大限制，资源浪费严重。而纤维素酶能破坏苦丁茶细胞壁纤维素的苷键，降解纤维素，使细胞壁疏松、破裂，减少提取过程中的传质阻力，从而提高提取效率[8-11]。本研究采用纤维素酶酶解—乙醇溶剂提取工艺提取苦丁茶中总黄酮，并采用单因素试验优化提取条件，以期为苦丁茶中黄酮类化合物的高效利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦丁茶购自福建省泉州市安溪县祥华乡祥溪茶厂。结晶氯化铝（AlCl3·6H2O），西安化学试剂厂；无水乙酸钠，北京化工厂；亚硝酸钠，莱阳市双双化工有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、冰乙酸，天津市红岩化学试剂厂；纤维素酶，北京惠泽奥公司；芦丁，中国药品生物制品检定所。试剂均为分析纯，所有试剂溶液均用蒸馏水配制。

主要仪器包括：UV-722S型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；电热恒温水浴箱，北京科伟永兴仪器有限公司；电子天平，上海精密仪器科学有限公司；高速万能粉碎机，天津市华鑫仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 苦丁茶中总黄酮的提取 苦丁茶粉末添加适量纤维素酶加入少量的乙醇水溶液和pH缓冲溶液酶解乙醇水溶液浸提恒温水浴抽滤得滤液测定滤液中总黄酮的含量。

1.2.2 提取液中总黄酮含量的测定 ①标准曲线的绘制。以芦丁为对照品，利用紫外可见分光光度计在510 nm波长处测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度A510 nm，绘制标准曲线得到芦丁在0～12 mg/mL范围内浓度与A510 nm呈良好的线性关系，回归方程为A=15.050C+0.038。②总黄酮浓度的测定。吸取10 mL苦丁茶总黄酮提取液于50 mL容量瓶中，加入10 mL 30%的乙醇（体积分数，下同）及2 mL 50 g/L的NaNO2，摇匀后放置6 min；加入2 mL 100 g/mL的AlCl3，摇匀后放置6 min；再加入20 mL 40 g/L的NaOH，混匀，用30%的乙醇定容至刻度，15 min后测定A510 nm，依据芦丁标准曲线回归方程计算提取液中总黄酮的浓度，计算苦丁茶粉末中总黄酮类化合物的提取率。

总黄酮提取率=（提取液体积×提取液中总黄酮化合物浓度）/苦丁茶粉末质量×100%

1.2.3 单因素试验 设置单因素试验分别考察酶用量、酶解时间、酶解温度、pH、乙醇体积分数和乙醇用量对总黄酮提取率的影响。①酶用量。称取5份0.5 g苦丁茶粉末置于50 mL容量瓶中，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg纤维素酶，加入10 mL 50%的乙醇，室温下酶解1.5 h后于70 ℃水浴5 min灭酶活，取出冷却后加入25 mL 50%的乙醇，40 ℃恒温水浴1.5 h后过滤，滤液用50%的乙醇定容至50 mL，稀释10倍，按“1.2.2”测定并计算苦丁茶中总黄酮的提取率。②酶解时间。分别称取5份0.5 g苦丁茶粉末，加入1.0 mg 纤维素酶，室温下分别酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，其余条件同①，计算总黄酮提取率。③酶解温度。分别称取5份0.5 g苦丁茶粉末，加入1.0 mg 纤维素酶，分别于40、45、50、55、60 ℃酶解2.0 h，其余条件同①。④pH。分别称取5份0.5 g苦丁茶粉末，加入1.0 mg纤维素酶，调节酶解体系pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0并放置20 min，置于40 ℃放置2.0 h。其余条件同①。⑤乙醇体积分数。分别称取5份0.5 g苦丁茶粉末，加入1.0 mg纤维素酶，调节酶解体系pH为4.5，放置20 min，加入10 mL体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，55 ℃放置2.0 h，其余条件同①。⑥乙醇用量。分别称取5份0.5 g苦丁茶粉末，加入1.0 mg 纤维素酶，调pH为4.5后放置20 min，分别加入20、25、30、35、40 mL 60%的乙醇，于55 ℃中放置2.0 h。其余条件同①。⑦验证试验。准确称取0.5 g苦丁茶粉末5份，在单因素试验确定的最佳试验条件下提取总黄酮，进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 酶用量对总黄酮提取率的影响

纤维素酶可使细胞壁部分破损，令细胞内膜系统破裂，增加膜的渗透性，减少总黄酮向主体溶剂扩散的传质阻力，有利于苦丁茶中总黄酮的浸出。纤维素酶添加量不同时苦丁茶粉末中总黄酮提取结果如图1所示。从图1可以看出，总黄酮提取率随酶用量的增加呈先升高后下降，随后又缓慢上升的趋势，酶用量为1.0 mg时总黄酮提取率最高，此时酶与底物的作用最强；继续增大酶用量，提取率下降；之后再增大酶用量，提取率又略有上升。

2.2 酶解时间对总黄酮提取率的影响

酶解时间与酶用量有较大关系，如果酶用量较大，则可适当减少酶解时间，而酶用量较少其酶解时间就相对较长。本研究仅就酶用量为1.0 mg时酶解时间对总黄酮提取率的影响进行考察，结果见图2。从图2可以看出，酶解时间从1.0 h延长到2.0 h，总黄酮提取率快速上升，之后总黄酮提取率随时间的延长而上升的趋势变缓，表明此时酶解反应已基本完成，且反应体系中酶解产物的浓度增加抑制了反应向正方向进行，所以最佳酶解时间为2.0 h。

2.3 酶解温度对总黄酮提取率的影响

温度对纤维素酶具有双重影响，一方面，温度升高，活化分子数增加，有利于酶催化反应进行，另一方面温度升高会导致酶蛋白逐渐变性失活，纤维素酶通常在40～60 ℃下活性最好，在酶适合的温度下，温度每升高10 ℃，其反应速率可相应地提高2～3 倍。不同酶解温度下总黄酮的提取率结果如图3所示。从图3可以看出，温度为55 ℃时总黄酮提取率最大，说明该温度有利于纤维素酶发挥其最大活性并保持其较好的稳定性，且利于黄酮类化合物向溶剂的扩散，从而提高总黄酮的提取率。

2.4 酶解pH对总黄酮提取率的影响

pH不仅能影响酶构象，也能影响底物的解离状态，从而对酶活力产生影响。纤维素酶在不同pH条件下对总黄酮提取率的影响结果见图4。由图4可知，pH为4.5时总黄酮提取率最高，可见试验所用纤维素酶的最适pH为4.5。

2.5 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

苦丁茶黄酮类化合物大多为含酚羟基较多黄酮衍生物，为强极性或弱极性物质，能溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，以不同体积分数的乙醇作为提取溶剂时总黄酮提取率结果如图5。由图5可以看出，总黄酮提取率先随着乙醇体积分数的升高而升高，当乙醇体积分数为50%～60%时，提取率高于其他处理，说明苦丁茶黄酮类化合物的极性与体积分数50%～60%的乙醇相似。由于乙醇体积分数为50%或60%时总黄酮提取率相差不大，从节约成本的角度考虑采用体积分数50%的乙醇作为提取溶剂。

2.6 乙醇用量对总黄酮提取率的影响

提取溶剂与有效成分结合是物理过程，提取溶剂量增大时有效成分与溶剂接触机会增多，总黄酮提取率将增加，试验结果如图6。由图6可看出，总黄酮提取率随乙醇用量增大逐渐升高，这是因随乙醇用量增大，溶剂与苦丁茶粉末间接触面积变大，从而有利于促进苦丁茶中总黄酮成分溶出。当乙醇用量为35 mL时总黄酮提取率达最大。乙醇用量继续增加，会导致提取液中总黄酮的浓度降低，浓缩回收难度增大，不利于后续试验。

2.7 验证试验结果

由以上单因素试验结果可知最佳提取工艺为每0.5 g苦丁茶粉末中添加1.0 mg纤维素酶、酶解时间2.0 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 4.5、乙醇体积分数50%、乙醇用量35 mL。在此条件下进行验证试验，重复5次，总黄酮的平均提取率为7.80%，RSD=1.4%，表明该试验结果是可靠的。

3 小结与讨论

采用纤维素酶酶解—乙醇溶剂法提取苦丁茶中的总黄酮类物质，通过单因素试验优化提取工艺，得到最佳的提取条件为0.5 g苦丁茶粉末中加入纤维素酶1.0 mg、酶解时间2.0 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 4.5，乙醇体积分数50%，乙醇用量35 mL；该条件下总黄酮提取率可高达7.80%。本试验在较温和的条件下能达到较好的提取效果，是一种高效、安全、简易的提取工艺。

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