白蚁纤维素酶研究进展

摘要 纤维素是地球上蕴藏最多的可再生资源，白蚁是自然纤维素的主要降解者。介绍了白蚁纤维素酶对纤维素开发利用的重要意义，并就白蚁纤维素酶研究进展作一简述。

关键词 白蚁；纤维素酶；纤维素；降解

中图分类号 Q556.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）21-0235-02

纤维素是自然界中分布最广、蕴藏最多的一种天然可再生聚合体。自然界年产量纤维素超过1011　t的，按能量换算约等于近7×1011　t石油，而且纤维素无污染可再生，能循环环保使用[1]。白蚁遍布于除南极洲外的六大洲，全世界已知有3　000多种白蚁，初步统计总量超过3.5×1017头，纤维素年均消耗量约7×108　t。目前制约纤维素广泛应用的主要因素是纤维素酶的酶稳定性差、催化效率低、人工提取和表达的酶纯化难度较大、进行工业化大规模经济生产较难。白蚁纤维素酶对纤维素的开发利用具有特别重要的意义，已成为国内外研究的热点。本文就白蚁纤维素酶的研究进展作一简述。

1 白蚁纤维素酶简介

纤维素酶是一组能够水解纤维素的葡萄糖苷键并转化成葡萄糖的多组分酶的总称。纤维素酶包括内切酶、葡萄糖苷酶和外切酶。纤维素需要这些酶的共同出现并且协同作用共同催化才能完全被降解。到目前为止，纤维素酶降解纤维素的催化降解机理仍未得到完全阐明。微生物（包括原生动物、细菌、真菌和放线菌等）、植物和节肢动物等都能分泌产生纤维素酶[2]，但白蚁是分泌产生纤维素酶的最大群体。

白蚁纤维素酶主要包括外源纤维素酶和内源纤维素酶。外源纤维素酶由白蚁消化道特别是中、后肠共生的微生物包括原生动物和细菌及高等白蚁巢体真菌分泌产生。目前，还有部分白蚁暂无内源纤维素酶发现的报道。一直以来，人们认为动物自身不含纤维素酶，以纤维素为食的动物是通过体内共生微生物来降解纤维素的。1963年，Marshall　et　al首次检测到动物能分泌产生内源纤维素酶。1998年，Watanabe　et　al在白蚁中克隆到内源纤维素酶，从而证实了白蚁自身也能分泌产生内源性纤维素酶[3]。

到现在，研究发现白蚁内源纤维素酶包括内切酶和糖苷酶，主要在白蚁中肠的上皮细胞和唾液腺分泌产生[4]，暂时还没有关于外切酶的报道。一些研究发现：白蚁纤维素酶的酶学特性、稳定性、含量、组成成分及其分泌部位等与白蚁的品级、产地和种类等相关。白蚁体内的纤维素酶存在着动态的协调平衡。绝大部分白蚁通过内源和外源纤维素酶的协调催化降解作用，在体内形成高效地纤维素酶降解催化体系，在其独特的肠道结构和共生微生物的帮助下，将纤维素转为葡萄糖等营养物质以维持自身和共生微生物的生长。白蚁内源纤维素酶与外源纤维素酶的相互协同降解机制，白蚁与其体内微生物的共生关系现未得到完全阐明。

2 白蚁纤维素酶研究进展

至今，纤维素酶的研究已经历酶的提取纯化和克隆表达2个发展阶段。目前，人们主要集中在对纤维素酶的结构功能研究以及纤维素酶的高表达加以经济应用方面，并已在催化机理、生物合成调控及工业生产应方面用取得较大进展。人们对白蚁纤维素酶的研究，首先是从其共生微生物分泌的外源纤维素酶开始的。

1925年，Cleveland　et　al指出白蚁共生原生动物在白蚁消化降解纤维素中起着重要作用[5]。1932年，Trager[6]发现白蚁肠道共生的鞭毛虫能够分泌纤维素酶。1938年，Hungate　et　al发现内华达古白蚁进食的纤维素1/2以上被其共生原生动物降解[7]。

2005年，Inoue　et　al在家白蚁共生原生动物中克隆到了纤维素酶基因[8]，从分子角度证明白蚁体内存在着原生动物分泌的外源纤维素酶。Knig　H、Drge　S和Tamburini　E　et　al先后分别在白蚁中分离获到具有纤维素酶活性的细菌[9]。

2007年，Warneck　et　al　[10]对高等白蚁后肠共生微生物进行研究，发现大量纤维素酶基因，表明白蚁肠道细菌对白蚁纤维素的水解具有重要的作用。高等白蚁则能利用蚁巢共生真菌食取纤维素酶来催化纤维素。Martin　et　al发现撒哈拉大白蚁通过食巢真菌间接获取外切葡聚糖酶[11]。

1998年，Watanabe　et　al通过试验在白蚁的唾液腺中克隆到纤维素酶，从而证实了白蚁内源性纤维素酶的存在。随着研究的不断深入，越来越多的内源纤维素酶基因得以发现，内源纤维素酶在白蚁降解纤维素过程中的作用越来越为重要。

1925年科学家发现了白蚁共生微生物降解纤维素的现象，但纤维素酶基因方面的研究始于20世纪70年代末。1982年，Whittle　et　al　[12]首次在微生物中克隆到纤维素酶基因。1998年，Watanabe　et　al首次克隆出白蚁内源纤维素酶基因。1999年，Tokuda　et　al克隆到纤维素酶全长基因并在大肠杆菌中得到表达[13]。

迄今为止，人们已经在白蚁肠道共生微生物中得到外源纤维素酶基因近1　000个，主要分属于糖基水解酶家族第45家族、第7家族和第5家族[14]，并已在大肠杆菌中成功表达近100个。白蚁内源纤维素酶基因已有20余种得到克隆，主要分属于糖基水解酶家族第9家族，目前也有不少在原核表达成功表达的报道。

目前，纤维素酶基因原核表达存在着产量低、活性弱、稳定性差和纯化难等的缺点，不适于工业大规模经济化生产。人们正尝试用真核表达系统来进行纤维素酶基因的表达研究，主要集中在酵母表达系统，并取得了一定的进展。同时，随着动物内源纤维素酶的发现的不断增多，为克服微生物分泌的纤维素酶原核表达的不足，白蚁内源纤维素酶的真核高效表达成为研究的热点。马斯科马公司发明一项白蚁纤维素酶在酵母中的异源表达的专利，能有效提高表达效果。

纤维素酶的最核心问题是酶稳定性差、催化效率低、人工提取和表达的酶纯化难度较大、工业化经济生产较难进行。因此纤维素酶的生物合成调控、降解催化机理和空间结构功能的基础理论研究，以及克隆和筛选出表达高活性纤维素酶的基因和利用分子生物学技术构建改造活性高、耐高/低温、耐酸/碱的纤维素酶生物工程菌的应用研究成为当今的主要研究方向。

近年兴起了基因重排、分子模拟和定点突变等技术，这些技术主要对蛋白质分子结构进行三维模拟，通过同源建模等手段进行理性分子设计，对天然酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性和耐酸碱性等进行合理化改造，具有较强的预见性和可操作性。

2002年，Attila　Nemeth　et　al　[15]对通过突变技术有效提高了纤维素酶的耐热性。2005年，JinFeng　NI　et　al[16]对4种白蚁纤维素酶基因进行改造，酶活性提高了10倍以上。2009年，Kim　Y　S　et　al　[17]通过定向进化有效提高了纤维素酶的活性，Liu　W　J　et　al　[18]则提高了纤维素酶的热稳定性。2011年，Liang　Chaoning　et　al　[19]将内切葡聚糖酶进行改造，酶活性增加了近2倍。华南理工大学对白蚁　Nasutitermes　takasagoensis的纤维素酶和来源于Thermom-onospora　fusca　的纤维素酶进行同源建模，并将重组后的纤维素酶在毕赤酵母中成功表达[20]。广西大学对家白蚁内切葡聚糖酶进行饱和突变，并取得一定结果[21]。

3 展望

白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖，白蚁体内就是一个微型的生物发酵器。若能模拟白蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系，必是解决当前环境问题、能源危机的一条重要途径。纤维素酶的结构与催化机理、白蚁与其共生微生物的协同降解机制以及定向设计并高表达活性高、稳定性强的纤维素酶以便工业应用是当前白蚁纤维素酶研究面临的主要任务。随着研究的不断深入，白蚁纤维素酶将在人类生活中发挥出更大的作用。

4 参与文献

[1]　ROSANNE　M.Measurement　of　saeeharifieation　by　cellulases[J].Enzyme　Mirob　Teehnol，1985（7）：65-87.

[2]　陆晨，陈介南，王义强，等.一株产纤维素酶真菌的筛选及产酶条件优化[J].中南林业科技大学学报，2006（6）：118-122.

[3]　杜蕾蕾.黑胸散白蚁肠道纤维素酶GHF7基因的克隆与分析[D].武汉：华中师范大学，2008.

[4]　杨天赐，莫建初，程家安.白蚁消化纤维素机理研究进展[J].林业科学，2006（1）：110-115.

[5]　谢磊，刘宁，黄勇平，等.台湾乳白蚁肠道鞭毛虫群落结构及三种研究方法的比较[J].昆虫学报，2011，54（10）：1140-1146.

[6]　TRAGER　W.A　cellulase　from　the　symbiotic　intestinal　flagellates　of　termites　and　of　the　roach[J].Biochemical　Journal，1932（26）：1762-1771.

[7]　杨飞飞，冯冠.白蚁肠道共生物降解木质纤维素机理研究进展[J].中华卫生杀虫药械，2010（6）：455-458.

[8]　赵凯，常志威，张小燕，等.白蚁肠道共生微生物多样性及其防治方法研究现状[J].应用与环境生物学报，2012，18（2）：331-337.

[9]　吴燕，侯信锋，迟绍丽，等.白蚁栖息环境中蜡状芽孢杆菌的分离及其纤维素酶活性分析[J].微生物学通报，2012，39（5）：638-644.

[10]　WARNECKE　F，LUGINBUHL　P，IVANOVA　N，et　al.Metagenomic　and　functional　analysis　of　hindgut　microbiota　of　a　wood-　feeding　higher　termite[J].Nature，2007，450（7169）：560-　565.

[11]　张玉金，郭华春，陈严平，等.鸡菌与其共生白蚁共生关系研究进展[J].食用菌学报，2010，17（3）：67-72.

[12]　WHITTLE　D　J，KILBURN　D　G，WARREN　R　A　J，et　al.Molecular　cloning　of　a　Cellulomonas　fimi　cellulase　gene　in　Escherichia　coli[J].Gene，1982，17　（　2　）：139-145.

[13]　刘瑞娴，曾文慧，李志强，等.室内饲养与野外台湾乳白蚁木质纤维素水解酶活性的比较研究[J].应用昆虫学报，2012，49（3）：715-720.

[14]　NAKASHIMA　K，WATANABE　H，SAITOH　H，et　al.Dual　cellulose　digesting　system　of　the　wood-feeding　termite，Coptotermes　formosanus　Shiraki[J].Insect　Biochem　Mol　Biol，2002（32）：777-784.

[15]　NEMETH　A，KAMONDI　S，SZILAGYI　A.Increasing　the　thermal　stability　of　cellulase　C　using　rules　learnedfrom　thermophilic　proteins：a　pilot　study[J].Biophysical　Chemistry，2002（132）：229-241.

[16]　NI　JINFENG，MOTOMI　T.Heterologous　Overexpression　of　a　Mutant　Termite　Cellulase　Gene　in　Escherichia　coli　by　DNA　Shuffling　of　Four　Orthologous　Parental　cDNAs[J].Biosci　Biotechnol　Biochem，2005，29（9）：1711-1720.

[17]　KIM　Y　S，JUNG　H　C，PAN　J　G.Bacterial　cell　surface　display　of　an　enzyme　library　for　selective　screening　of　improved　cellulase　variants[J].Applied　and　Environmental　Microbiology，2000（66）：788-793.

[18]　LIU　W　J，ZHANG　X　Z，ZHANG　Z　M，et　al.Engineering　of　clostridium　phytofermentans　endoglucanase　Cel5A　for　improved　thermostability[J].Applied　and　Environmemtal　Microbiology，2010，76（14）：4914-4917.

[19]　LIANG　CHAONING，FIORONI　M，ROPERO　F　R，et　al.Directed　evolution　of　a　thermophilic　endoglucanase（Cel5A）into　highly　actove　Cel5A　variants　with　an　expanded　temperature　profile[J].Journal　of　Biotechnology，2011（154）：46-53.

[20]　刘慧琳，曹以诚，杨磊，等.白蚁纤维素酶结构域重组研究[J].广东农业科学，2011（9）：152-154.

[21]　林丽华，秦国梅，韦宇拓，等.台湾家白蚁内切葡聚糖酶活性中心氨基酸的饱和突变[J].生物工程学报，2009，25（6）：927-931.