动物转基因研究进展

摘要动物转基因技术是一项新的生物学技术，可应用于畜牧业及生物医学等领域。对转基因动物的制作方法及应用进行了综述，对其发展趋势进行展望，以促进动物转基因研究的开展。

关键词转基因动物；畜牧业；生物医学

中图分类号Q785文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）0２-0323-04

ResearchProgressofAnimalTransgenic

YANG Hui-ting 1，2WANG Hong-mei 2SUN Tao 2GAO Yun-dong 2 ZHONG Ji-feng 2HE Hong-bin 2 *

（1 College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan Shandong 250030； 2 The Research Center of Dairy Cow，Shandong Academy of Agricultural Science）

AbstractAnimal transgenic technique is a new biological tool，and is applied in a few of fields，such as animal husbandry and biomedical science.The status of production and application of transgenic animals were summarized，and the development trend was analyzed，in order to improve the study of animal transgenic.

Key wordstransgenic animals；animal husbandry；biomedical science

动物转基因技术是20世纪80年代初发展起来的一项新的生物技术，该技术克服了动物物种之间固有的生殖隔离，实现了不同物种之间遗传物质的交换和重组。经过科学工作者多年的努力，转基因研究已经取得许多开创性的成果，在基础生命科学、医学以及农学等一系列领域中展现出非常广阔的应用前景，备受各国科学家的关注。该文对转基因动物的制作方法及应用进行概述，对转基因技术存在的问题进行分析，并对动物转基因的发展趋势进行展望。

1制作转基因动物的方法

转基因动物是指那些通过导入外源DN段，继而在其染色体组上稳定整合并可遗传给后代的动物，是重组DNA技术和胚胎技术发展的必然结果。制作转基因动物的方法主要有原核显微注射法、胚胎干细胞法、转基因体细胞克隆法、病毒载体法等。

1.1原核显微注射法

原核显微注射法是将表达载体直接注射到受精卵原核内部，需要专业的显微操作设备，是经典的转基因动物制备方法[1]。1980年Gordon等[2-3]利用显微注射法成功获得转基因小鼠，并且外源基因能够稳定整合和遗传。1982年Palmiter等[4]构建了金属硫蛋白（MT）启动子驱动的大鼠生长激素基因重组表达载体，将其显微注射到小鼠原核期胚胎，获得了含有外源生长激素基因的体型巨大的超级小鼠。随后，Hammer等[5]利用该方法成功地制作了转基因兔、绵羊和猪，被认为是动物转基因研究历程上的里程碑。然而，显微注射法中外源基因整合的拷贝数和整合位点都是不确定的，当外源基因整合到染色体组的非活跃区时，会产生位置效应，导致其低表达或不表达；同时，该方法生产转基因动物的效率低，后代嵌合体比例高，尤其是大动物，受体需要量大，风险大，造成大型动物制备的成本高，极大地制约着转基因动物的产业化。

1.2病毒载体法

病毒载体法主要包括慢病毒/逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒及在此基础上改造的假型病毒等，该文主要介绍慢病毒/逆转录病毒载体法。

逆转录病毒是RNA病毒，包括白血病病毒及艾滋病病毒等，可以感染哺乳动物并引起多种疾病，如疱疹、癌症、免疫缺陷综合症等。病毒感染细胞后，病毒RNA进入细胞并转换为DNA分子，然后比较容易地整合到宿主细胞基因组内，故逆转录病毒是有效的转基因载体。1975年Jaenisch等[6]利用鼠莫洛尼氏白血病病毒（Moloney leukemia virus，M-MuLV）感染小鼠胚胎，成功地制备转基因动物。Rogers等[7]采用禽白血病病毒感染早期的鸡胚胎，得到转基因鸡，Haskell等[8]人应用该方法获得转基因牛。然而简单的逆转录病毒载体法有一定的局限性，如外源基因只能与分裂期细胞基因组整合，只对部分细胞具有侵染性，不能感染合子期单细胞，易形成嵌合体转基因动物等，逆转录病毒科中的慢病毒可以部分克服上述缺点。2006年Golding等[9]使用慢病毒载体法制备抑制朊病毒蛋白质表达的转基因山羊；2009年Gómez等[10]获得了人表皮生长因子受体转基因克隆猫，Ramsoondar 等[11]获得了表达小干扰RNA的转基因猪，Sasaki等[12]成功获得含GFP标记基因的转基因狨猴。上述研究表明，由逆转录病毒/慢病毒载体携带的外源基因不仅在多种器官组织中表达，并且可稳定遗传。

慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗中载体研究的热点。然而其携带的外源基因一般小于10 kb，因是随机整合，故易引起插入突变，其LTRs可能干扰哺乳动物启动子，转基因动物可能是嵌合体。另外，慢病毒载体的安全性一直是人们关注的热点问题，上述问题将制约其在转基因产业化进程中的应用。

1.3胚胎干细胞转染法

从早期小鼠胚胎中获得的胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES）[4]，可在滋养层或条件培养基中培养，将外源基因重组载体转染ES细胞获得转基因ES细胞，再将其注射进囊胚，并将感受态囊胚移植进假孕母鼠的体内，获得嵌合体转基因小鼠。经过常规育种扩繁技术，最终得到可稳定遗传的转基因小鼠新品系。该方法的最大优点是通过同源重组构件的转染，进行基因打靶，可精确定位外源基因整合位点，解决了原核显微注射随机整合的难题。小鼠胚胎干细胞制备技术已经成熟，而家畜是否具有胚胎干细胞及其ES细胞的分离、培养等还在探索中。因此，该方法主要用于小鼠转基因动物模型的制备。

1.4转基因体细胞克隆技术

转基因体细胞克隆技术是基因组修饰技术与动物体细胞克隆技术有机结合而产生的一种新的转基因动物制作技术，是将外源基因导入能够传代培养的动物体细胞，再以转基因体细胞为核供体细胞，通过核移植、胚胎移植等动物克隆技术获得转基因动物的方法。1997年英国Roslin研究所的Wilmut[13]研究小组向世界宣布，世界上第一只克隆绵羊Dolly诞生，确认了哺乳动物体细胞在特定条件下的全能型，是生物技术史上的重大突破，为利用转基因体细胞克隆技术制备转基因动物的研究奠定了基础。同年该研究小组报道，用转基因胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊Polly [14]，这标志着体细胞克隆介导的转基因技术的成功问世。1998年Cibelli等[15]通过该技术成功制作含有Lac Z基因的转基因牛；1999年Baguisi等[16]获得了含有人抗胰蛋白酶（hAT）基因的转基因奶山羊；2008年Rogers等[17-18]成功得到囊性纤维膜传导受体基因（CFTR）敲除猪，建立了囊性纤维化病的动物模型。

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2转基因动物的应用

利用转基因技术有目的、有计划地改变动物的遗传组成成分后得到的转基因动物，其应用涉及医学疾病模型、生物制药及农牧业等领域。

2.1培育家畜抗病新品种

传统的家畜育种是通过经典的物种选择方法进行培育，其局限性主要有2个方面。首先，遗传信息只在同种或亲缘关系很近的种间才有可能变换重组。其次，新种选择的先决条件是变异或突变，而天然的突变频率是极低的。随着转基因技术的不断完善和成熟，人们可成功地避开物种间杂交不育的生殖隔离，打破物种界限，突破亲缘关系限制，进行基因交流，培育出自然界和常规育种难以产生的具有特别优良性状的品种或种群，其中抗病转基因动物的培育受到了广泛的关注。

病毒性脑膜炎病毒引起家畜急性中枢神经系统感染性疾病，造成巨大的经济损失。1994年Clements等[19]得到了表达Eve基因的母羊，其血液中能够检出Eve糖蛋白的免疫抗体。

奶牛炎是世界范围内危害奶牛养殖业的常见传染性疾病，严重影响产奶量、乳脂率以及牛奶的品质。金黄色葡萄球菌是引起炎的主要病原体之一，目前不论是疫苗还是抗体，都不能很有效地抑制或者抵抗这种微生物。2001年Kerr等[20]将溶葡球菌酶基因转入小鼠乳腺中，高表达该基因的小鼠具有明显的抗菌性，这对于降低奶牛炎的发生率具有潜在的应用前景。Donovan等[21]制备编码溶葡球菌酶基因转基因牛，其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由金黄色葡萄球菌引起的炎，转基因牛葡萄球菌感染率可降低到14%，而非转基因牛感染率高达71%。Maga等[22]研究表明，转基因山羊表达的重组溶菌酶能有效抑制奶嗜冷腐败菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。

Pfeifer等[23]将沉默Prp基因的小RNA干扰片断（RNAi）转入小鼠原核细胞核内，获得的转基因小鼠接种感染性朊病毒后，其存活时间长于野生型小鼠。2006年Golding等[9]利用RNAi技术针对引起牛疯牛病和羊痒病的Prp基因序列设计有效的RNAi，获得1头转基因羊胎儿，检测发现RNAi很好地抑制了体内Prp基因的表达。2006年Yu等报道利用基因打靶技术获得敲除了朊病毒一个Prp基因位点的体细胞克隆山羊，经过3个月观察，这些基因敲除羊没有异常表现。2007年Richt等利用基因打靶技术灭活牛的PRNP基因，获得生长发育正常、存活2年以上的转基因牛，它们能够很好地抵抗疯牛病的传染。因此，利用转基因动物制作技术提高动物的抗病性具有十分乐观的前景。

2.2家畜肉产品质量和产量的改良

从畜牧业发展角度出发，创造具有新的遗传性状的动物品系，可以加快改良遗传性状的进程，使选择的效率提高，得到更优质的农产品。1986年Hammer等[24]首次将人生长激素基因导入猪受精卵，成功获得转基因“超级猪”，其日增重、粗饲料转化率、背膘厚度等指标均较正常对照组有明显的提高。1990年Wieghart等[25]将大鼠磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子驱动的牛生长激素基因（PEPCK-bGH）重组载体显微注射早期猪胚胎，培育出的转基因猪的背膘厚度与同窝对照组相比降低了41%。

菠菜根部的FADZ基因编码一种具有将饱和脂肪酸转换为不饱和脂肪酸的酶，2004年日本Kinki大学的Saeki等[26]成功培育出不饱和脂肪酸含量高的FADZ基因转基因猪，其体内的不饱和脂肪酸要比一般的猪高约20%，从而提高了猪肉的质量，同时证明植物基因能够在动物体内发挥作用，并改善动物产品质量。

2.3建立动物生物反应器

将由不同组织特异性启动子驱动的外源基因导入受体细胞并整合其基因组中，细胞分化后发育成的动物个体可以按照人类的需要生产出产物，被称为“活体生物反应器”，包括动物血液系统、动物膀胱、禽类的卵及哺乳动物乳腺等生物反应器。1992年Swanson等[27]制备了血液中含有人血红蛋白的转基因猪，为从动物体获取珍贵的人血有效成分提供了新思路。1998年Kerr等[28]获得能在尿液中表达人生长激素（GH）的转基因小鼠，含量高达0.5 g/L。2002年Harvey等[29]成功获得含β-内酰氨酶基因的转基因母鸡，蛋清中含有约3.5 g外源蛋白。乳腺被认为是最天然和最有效的外源蛋白生产者，如凝血因子VIII [30]、人凝血因子Ⅸ[14]、人乳铁蛋白[31-32]、人胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）[33]、人生长激素（hGH）[34]、人溶菌酶[35]、人促红细胞生成素（hEPO）[36]、人甲状旁腺激素[37]和牛酪蛋白[38]等。

目前，我国用于生产重要的重组蛋白质药物的转基因牛、奶山羊和转基因兔等已相继诞生，这标志着我国在转基因动物制药方面的研究已达到相当的水平，利用乳腺生物反应器大规模生产人类所急需的外源活性蛋白是当前生物技术领域的研究热点之一。

2.4建立人类疾病的动物模型

根据某基因对机体生理状况的影响，建立疾病的转基因动物模型，进而深入研究相关疾病的发病机理，探索其有效的治疗方法，将对医药产业产生深远影响。

人类约有20 000~25 000个基因，已知的人类疾病有数千种，其中很多是由基因突变所导致的。在20世纪80年代之前，人们只有通过鉴定自发突变个体表现出的表型研究人类遗传性疾病，随着转基因技术的发展，通过有目的精确地失活或增强某些基因的表达建立人类遗传性疾病的转基因小鼠模型，为疾病病症和致病因素研究奠定了坚实的基础[39]。大型家畜作为需要较长观察期疾病的动物模型更为合适，如猪、羊、牛等。视紫红质与夜盲症有关，将猪的视紫红质基因突变[40]，其表现出与人类表型相似的性状，可以用来对色素性视网膜炎致病机理和治疗进行研究。生长激素释放激素异常与Turner氏综合症、Crohn氏疾病、肾功能不全、子宫生长停滞等有关，可用生长激素释放激素基因突变的猪模型进行探索性研究[41]。

小鼠等非灵长类动物的解剖学、生理学都明显区别于人类，其作为人类疾病模型具有许多局限性。转基因狨猴是传染病、免疫学和神经障碍性疾病很好的模型，利用含有可导致肌营养不良的突变基因的转基因狨猴为模型，可加快该疾病防治研究的进度[42]。2009年Sasaki等制备了含GFP标记基因并可以遗传给后代的转基因狨猴，将应用于生物医学研究的很多领域。

已建立转基因动物模型的人类遗传病包括多种癌症[43]、心脏病[44]、动脉粥样硬化[45]、帕金森病[46]、老年痴呆症[47]、焦虑症和抑郁症[48]等，为人类疾病的研究与治疗提供了强有力的支撑。

3问题与展望

转基因动物的生产及相关产品已显示出了广阔的应用前景与重大的应用价值，然而作为刚刚起步的生物高新技术仍存在一些缺陷，主要问题包括：转基因动物特别是转基因家畜的外源基因整合率及表达效率低；对转基因动物制作的精细理论及整个过程的调控尚不清楚；转入的基因在宿主基因组中的行为难以控制，其插入可能造成内源基因的破坏，还可能激活原本已关闭的基因，从而导致动物出现异常，如阳性个体不育、胚胎死亡、四肢畸形等发育异常现象；转基因动物及其相关产品的安全性有待进一步研究等。

为使转基因动物发挥更大的作用，需要对转基因动物制备技术的各个环节进行不断探索，以提高转基因动物的成功率，包括对不同物种外源基因载体的制备与选择、对基因转移技术的优化、提高体细胞核移植的效率等，最关键的问题是转基因动物的制备是多学科交叉和综合的新技术，相关基础理论是技术突破的瓶颈。因此，各技术与理论的进一步完善和完美结合，将会为转基因动物产业化与商品化铺平道路，并大大推动相关产业的发展。令人鼓舞的是美国FDA在2006年宣布从克隆动物中获得的食品进入食物链是安全的，同年美国GTC Biotherapeutics公司利用山羊乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶III（商品名：ATryn）获得欧洲药监局批准，Atryn可以阻止遗传性抗凝血酶缺陷症患者体内形成过多血栓；2009年2月6日获得FDA批准上市，该新药的诞生标志着一场生物制药革命的开始。

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