pH敏感脂质体的研究

《药物生物技术杂志》2014年第二期

1pH敏感材料

1.1合成pH敏感材料

具有长循环作用的酸敏感材料在pH敏感脂质体的制备过程中加入一部分表面带有亲水性集团的化合物，如经PEG或者是PAA等亲水性集团进行修饰，或者是加入一些表面活性剂，增加脂质体表面的亲水性，从而回避网状内皮系统对脂质体的吞噬，延长pH敏感脂质体在体内的作用时间。Fonseca［11］等对硫醇盐转酰亚胺的共价偶联进行了探讨，在室温和中性pH条件下在硫醇盐中将酰亚胺与PEG远端偶联并嵌入磷脂双分子层中，这种方法被认为是巯基与马来酰亚胺之间最有效的偶联方法。制备了包载转铁蛋白的pH敏感脂质体，同时具有长循环的作用。Lee［12］等将二棕榈酰卵磷脂∶二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)∶胆固醇按照摩尔比51.4∶3.6∶45的比例放置过夜生成聚合物交联脂质体，然后再交联上聚丙烯酸(PAA)获得了pH敏感的笼型脂质体。流体动力学直径显示交联效果较好，同时也证明了胆固醇交联的聚丙烯酸可以任意插入已知的脂质体，然后交联成稳定的脂质双分子膜，实验显示其pH敏感性良好。经过修饰的羧甲基壳聚糖同时兼具酸敏感性与长循环的特点。钱秀珍［13］等将壳聚糖经过羧甲基化后生成一种水溶性的衍生物羧甲基壳聚糖(CMCT)，是一种两性聚电解质，在不同的pH值下具有不同的构像，将其修饰到脂质体的表面，使其在不同pH值下其构象不同其作用力不同将脂质体内包裹的药物释放，达到pH敏感性，并可以有效地改变脂质体颗粒的亲水性，CMCT的亲水链包裹在脂质体周围并对血液中的蛋白有排斥作用，可以延缓调理作用，同时达到体内长循环隐形的目的。

1.2具有穿膜作用的酸敏感材料氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，其生物相容性好，安全无毒，容易被机体代谢吸收，氨基酸所组成的穿膜肽是近年来研究的热点，细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用，将穿膜肽连接在pH敏感脂质体上能够显著提高入胞的药物量。聚氨基酸由于其显正电性，在包载基因方面拥有独特的优势，能够显著提高基因的转染效率。Eiji［14］等实验室合成了酸敏感性的聚缩水甘油衍生物:琥珀酰化聚缩水甘油、戊二基酰化聚缩水甘油，用这两个聚合物修饰后对HepG2、Hela细胞进行转染。对HepG2细胞的转染效率分别为20%，40%左右，对HeLa细胞的转染效率为55%，80%左右。用相同的处方对树突状细胞进行转染，结果证明连接有pH敏感性聚合物的脂质体与阳离子脂质体相比，能将转染效率提高15%左右。Obata［15］等人合成了全新的聚氨基酸L1和L2作为酸敏感材料，并用二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇和上述材料制备包载多柔比星的pH敏感脂质体，用上述材料做成的脂质体在低pH值时带正电，在高pH值时候带负电，通过不同pH值下的粒径和Zeta电势验证其具有良好的pH敏感性，细胞毒性试验显示聚氨基酸L1和L2制备的脂质体的IC50值明显低于DPPC与胆固醇作为脂质材料制备的普通脂质体，加入聚氨基酸材料所制备的pH敏感脂质体在血液内的停留时间和对肿瘤的抑制作用都显著高于普通脂质体。Naik［16］将RGD肽通过PEG交联到多西他赛脂质体上，细胞实验显示连有RGD肽的脂质体对BT-20和MDA-MB231的IC50值显著小于未连RGD肽的脂质体，流式细胞仪结果显示在24h时，在药物浓度5mmol/L时，连有穿膜肽的多西他赛脂质体能将51%的细胞被阻止在G2期，未连有穿膜肽的多西他赛脂质体只能将30%的细胞阻止在G2期，结果显示其呈时间和浓度依赖性。有研究报道，TAT介导的pH敏感脂质体［17］介导的药物向肿瘤部位的转运至少提高了3倍，肽类也可以与药物通过酯键或者腙键偶联［18-19］，在低pH值的肿瘤部位，酯键或者腙键断裂，从而释放药物。

1.3天然酸敏感材料人体内本身就含有的油酸就是很好的酸敏感材料，其亲水端在不同pH值下呈现不同的形态，从而控制药物的释放，Fang［26］将PE∶CHOL∶OA按照6∶4∶3比例用逆向蒸发法制备了酒石酸长春瑞滨pH敏感脂质体，包封率为81.2%，载药量为16.6%。将游离酒石酸长春瑞滨与酒石酸长春瑞滨pH敏感脂质体在pH7.4、5.0的PBS缓冲液中观察其释放规律，酒石酸长春瑞滨脂质体具有缓释作用，而且在pH5.0缓冲液中释放较快，具有pH敏感性。小鼠体内试验显示酒石酸长春瑞滨脂质体能够提高生物利用度，降低在心、肾部位的毒性。琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS)，其结构为胆固醇上交联一个琥珀酸形成的单酯，能够抗恶性肿瘤增生，降低药物对细胞的毒性，调节细胞中酶的活性。其它能够作为脂质体的稳定剂，同时兼具酸敏感的功能［21］。Ponnappaa［22］制备了PE∶CHEMS∶CHOL为7∶4∶2的酸敏感脂质体，并包载反义核苷酸，靶向肿瘤坏死因子。并用此脂质体作用于长期喂养乙醇导致的肝癌的小鼠，结果显示给药一段时间后，肝损伤程度显著降低。众多文献显示，即使是相同的材料，但是在不同的配比下，具有不同的临界pH点，甚至有的配比不具有酸敏感性。Petescu［23］等比较了不同pH敏感材料不同比例时所显示的pH敏感性。发现本身具有酸敏感基团的材料以不同比例混在一起后有的具有pH敏感性，有的不具有pH敏感性，如PE∶CHEMS或DOPE∶CHEMS为3∶2时具有pH敏感性，而PC∶CHOL或PC∶CHEMS为3∶1时均不具有pH敏感性。运用带有阴离子的CHEMS与带有阳离子的DODAC制备脂质体，临界pH值由阴阳离子的比例决定，实验显示CHEMS越多临界pH值越小，用冷冻断裂显微镜观察脂质体的形状，从而确定其临界pH值。文献报道临界pH值［24］的计算公式如下pHn=PKCHEMS+log10［XDODAC/XCHEMS－XDODAC］。根据这个公式，我们可以调控其比例达到我们需要的临界pH值，有望实现脂质体的可控制备。

2pH敏感脂质体包载的药物

脂质体由于其具有类脂双分子层，内部又具有水腔，所以脂质体可以包载脂溶性药物和水溶性药物，也可包载蛋白类药物，聚氨基酸作为材料制备的阳离子脂质体在包载基因类药物具有一定优势。

2.1包载脂溶性药物脂溶性药物难溶于水，上市制剂常采用加入表面活性剂等来增溶，因而产生一些变态反应。脂质体具有类脂双分子层，具有包载脂溶性药物的天然优势，所包载的脂溶性药物包封率普遍较高，周奕［25］等采用逆向蒸发法制备药物磷脂复合物脂质体，利用羧甲基壳聚糖与脂质体表面的静电吸附作用，使羧甲基壳聚糖吸附在脂质体表面，制备乳糖化-去甲斑蝥素磷脂复合物pH敏感型脂质体。药物磷脂复合率为(97.2±2.01)%，磷脂复合物脂质体的平均包封率为(70.0±1.30)%，平均粒径为(47.18±4.16)nm，粒径跨距为(0.70±0.07)nm，药物与磷脂的复合与药物磷脂的物理混合不相同，从DSC结果看出会使相变温度降低，复合率越高，其包封率越高。电镜显示其形态圆整，体外释放试验显示具有缓释特性。

2.2包载水溶性药物pH敏感脂质体脂质体包载水溶性药物，目的是利用脂质体的生物相容性，和主动靶向作用，靶向肿瘤细胞，减少药物在其他组织的毒性，增加肿瘤部位的药物浓度，提高治疗效果。武鑫鹏［26］等采用薄膜分散法制备牛蒡苷pH敏感脂质体。利用三因素三水平Box-Behnken效应面设计法筛选牛蒡苷pH敏感脂质体的最佳处方，平均包封率为(93.25±1.5)%，平均粒径为(208.55±2.8)nm。用Box-Behnken实验设计法优化牛蒡苷pH敏感脂质体处方可得到较高包封率、稳定性优良且pH敏感性良好的产品，并为今后进行体内剂型研究奠定基础。

2.3包载基因类药物基因治疗是肿瘤生物学治疗中的重要组成部分，已经在许多肿瘤治疗中显示出良好的应用价值，并逐渐成为一项有前景的治疗方式。包载基因常用的载体分为病毒载体和非病毒载体。pH敏感脂质体包载基因具有病毒所不具有的优势，其安全、无毒、主动靶向作用，是近年来研究的热点。JensS［27］采用溶剂除去法制备了PEI/DNA与pH敏感脂质体复合物，与单纯PEI介导的相比，该复合物在氨基葡萄糖缓冲液中更加稳定。体外释放试验显示，将单纯PEI介导的DNA加入到含5%氨基葡聚糖的缓冲液中，5min后，80%DNA从聚合物中释放出来;而PEI/DNA与pH敏感脂质体复合物其24hDNA释放量低于10%，具有缓释效果。而且复合物对CV1-P细胞的转染效率与单纯PEI介导的基因转染效率相当。

2.4包载蛋白类药物蛋白类药物真正运用到临床上的较少，因为其在血液中能快速被淋巴循环所代谢，或者被网状内皮系统吞噬。pH敏感长循环脂质体能够克服蛋白类药物的缺陷，从而有望将更多的蛋白类药物应用于临床。Ducat［28］等人制备了pH敏感长循环脂质体［DOPE∶CHEMS∶CHOL∶PEG750-DSPE(43∶21∶30∶6)］与普通长循环脂质体［SPC∶CHOL∶PEG-750-DSPE(47∶47∶6)］，同时包载蛋白类药物，比较了制备好的脂质体的粒径、电势、包封率、形态，还通过细胞摄取实验比较了两种脂质体的不同。结果显示，两种制剂的理化性质无显著差异，细胞摄取实验显示出pH敏感脂质体的优越性，比起制备的长循环脂质体，长循环pH敏感脂质体能够较好地将蛋白类药物靶向到MDA-MB-231的细胞核中。

3结语

pH敏感脂质体作为药物载体具有良好的应用前景，在有效减低细胞毒性，提高药物的靶向性，提高治疗效果等方面，显示出独特的优势，是具有良好应用前景的药物传递系统。由于水溶性药物和蛋白类药物在制备时必须包封在脂质体囊内部或多层脂质体层间的水性介质中，所以包封率普遍较低，而且容易泄露，可以通过主动载药法或者是将药物制成前体药物增大其脂溶性提高其包封率。另外pH敏感脂质体的敏感机制也有待于进一步详细的研究。目前pH敏感脂质体的研究大多仅仅处于实验室阶段，主要原因是药物载体的性能尚不能完全满足要求，相信在不远的将来，随着科学技术的发展和制备工艺的改进，人们一定能够制备出自我感知、自我调节更加理想的pH敏感脂质体。

作者：卢杉杉邵伟李荫林贵梅单位：山东大学药学院药物制剂研究所 烟台海军航空工程学院基础实验部