两种抗菌肽的体内外抗菌功能

《药物生物技术杂志》2014年第二期

1材料与方法

1.1材料

1.1.1抗菌肽LL-37及其改造变异体LL-21和LL-29人源抗菌肽LL-37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFL-RNLVPRTES)及其改造变异体LL-21(FKRIVQRIKDFLRN-LVPRTES)和LL-29(SKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRN-LVPRTES)委托上海吉尔生化公司合成，纯度大于98%，合成的抗菌多肽通过自动氨基酸序列测定验证其序列正确性，并通过质谱验证其分子质量和纯度。

1.1.2微生物菌株试验菌株:大肠杆菌EscherichiacoliATCC25922、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC2592、枯草芽孢杆菌Bacillusdysenteriae、白色念珠菌CandidaalbicansATCC2002、绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa、肺炎球菌Streptococcuspneumoniae、肠球菌Enterococcusfaecalis以及对应的临床分离的耐药微生物来源于昆明医学院。

1.2方法

1.2.1抗菌活性筛选以及最小抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)的测定每毫升含106细菌或孢子的菌液均匀涂布于固体细菌培养基表面，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加一定浓度的待测样品溶液，于37℃培养18～20h，观察抑菌圈形成与否，有抑菌圈形成的表明有抗菌活性，进一步进行最小抑菌浓度的测定。测定最小抑菌浓度时，采用二倍稀释法进行抗菌检测。以Luria-Bertani(LB)液体培养基作为培养介质。标准菌株经LB固体培养基复苏后，用无菌水稀释菌落成每毫升含106细菌或孢子的菌液，将菌液接种于LB液体培养基，细菌最终浓度为105/mL。在1.9mL培养基中加入经0.22μm孔径膜过滤的溶解于生理盐水的抗菌肽样品0.1mL作为第一管，混匀后取1mL加入第2管，依次倍比稀释，自第9管吸出1mL弃去，第10管系对照管。

1.2.2溶血及出血活性检测

1.2.2.1溶血测定将人全血与阿式液(AlseverSolution)按1∶1比例混合置于离心管中，2000r/min离心，用生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止。将上述洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成107～108浓度的悬浮液。上述稀释好的悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品37℃保温30min，2000r/min再离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用1%TritonX-100。溶血活性与540nm吸收值成正比。局部出血测定:0.05mL溶解于生理盐水不同浓度的样品sc于昆明小白鼠(202g)，注射后2，4，6h以及过夜观察局部有无肿胀及出血。对照组动物注射同样体积的生理盐水。

1.2.3体外血清杀菌动力学研究取80μL人血清与20μL不同浓度的抗菌肽混合，血清混合物加入50个左右的微生物细胞，于37℃孵育不同时间段后，全部血清混合物涂布于90cm直径含有LB固体培养基的培养皿，37℃培养过夜，记数微生物菌落。同时以1，5，10倍最小抑制浓度的抗生素泰能(亚胺培蓝)作为阳性对照。

1.2.4体内抗菌活性测定通过腹膜炎模型实验测试抗菌肽的体内抗感染活性，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别过夜培养到对数生长期，生理盐水洗2次后，用生理盐水稀释到菌液浓度为1×1011细胞/mL，每只小鼠ip200μL。细菌接种1h后注射样品，样品用生理盐水溶解为20mg/mL，按照20mg/kg的剂量每只小鼠尾静脉注射20μL。同时阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组注射泰能(20mg/kg)，每组取8只小鼠，重复试验3次。

2结果

2.1抗菌肽LL-37、LL-21和LL-29的体外抗菌活性对于每种微生物，分别测试10株不同血清型的微生物菌株，包括标准菌株和临床分离菌株。3种抗菌肽对10株不同血清型的微生物菌株的最小抑菌浓度如表1所示。结果表明，所有这3种抗菌肽对测试的微生物菌株都具有显著的抗菌活性，尤其是对肺炎球菌、肠球菌和绿脓杆菌具有强的抗菌能力。在这3种抗菌肽中，LL-21对所有测试的微生物菌株具有最强的体外抗菌活性。如LL-21对测试的10株肺炎球菌中的2株菌株的最小抑菌浓度为0.25μg/mL，对测试的10株绿脓杆菌的1株菌株的最小抑菌浓度只需要0.125μg/mL。

2.2溶血及出血活性检测LL-21，LL-29和LL-37对人红细胞都表现出很弱的溶血能力，即使在这些抗菌肽浓度为500μg/mL的浓度条件下，他们对人红细胞的溶解率分别为1.9%，2.7%和2.5%。这些结果表明，这3种抗菌肽基本上不具有红细胞溶解能力，适合于作为临床用抗感染药物的开发。20μL0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL，5mg/mL浓度的这些抗菌肽被分别sc于小鼠，作用于不同时间后，解剖实验动物，所有这些剂量的抗菌肽都不导致出血斑的出现。这些结果表明，这3种抗菌肽基本上不具有出血活性。

2.3体外血清杀菌动力学以泰能作为阳性对照，研究了LL-21、LL-29和LL-37在体外血清中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌动力学特征(表2和表3)。1倍最小抑菌浓度的的这2种抗菌肽(浓度分别为8和1mg/L)可以在1h内彻底杀灭这2种微生物，而阳性对照泰能即使在10倍最小抑菌浓度的条件下，通过3h的作用时间也不能彻底杀灭微生物。1倍最小抑菌浓度的泰能在血清中不足以杀灭微生物，如表2、表3所示，随着1倍最小抑菌浓度的泰能在血清中与微生物共培养时间的延长，菌落数量在显著增加。这些结果表明抗菌肽具有比泰能有更好的杀菌效率，且杀菌所需时间比泰能要少得多。

2.4体内抗菌活性由2种微生物造成小鼠急性腹膜炎模型，以泰能作为阳性对照，测试3种抗菌肽对急性腹膜炎小鼠存活率的影响，结果如表4和表5所示。所有这3种抗菌肽都可以显著提高急性腹膜炎小鼠的存活率，他们的效果都明显地好于泰能。尤其是LL-21在不同时间段引起的小鼠存活率都是最高的。在作用于大肠杆菌导致的急性腹膜炎小鼠12h以后，LL-21引起的小鼠存活率为60%，泰能作用的存活率仅为30%。对于金黄色葡萄球菌导致的急性腹膜炎小鼠，LL-21作用12h导致的小鼠存活率为55%，而泰能作用的存活率仅为26%。

3讨论

基于抗菌肽LL-37的氨基酸序列特性，通过序列改造与优化，得到了2种抗菌肽变异体(LL-21和LL-29)，它们分别含有21和29个氨基酸残基。尽管其序列长度分别缩短了16和8个氨基酸残基，但是其抗菌功能得到了改善。如表1～5所示，无论在体外还是在体内，这2个抗菌肽变异体都比其母体(LL-37)具有更强的抗菌能力。考虑到这些抗菌肽的强大的抗菌能力，因此进一步研究了其溶血活性和出血活性。这些抗菌肽在高剂量条件下都不会导致人红细胞溶血以及不导致小鼠出血。这些结果暗示这些抗菌肽具备作为临床抗感染药物的潜力。相比之下，有些抗菌肽尽管具有很强的抗菌能力，但是由于他们对真核生物细胞膜具有较强的破坏作用而不适宜作为临床用抗感染药物。LL-21，LL-29和LL-37在体外血清中的杀菌动力学研究表明，这些抗菌肽比临床用抗生素(泰能)具有更短的杀菌作用时间，在不到1h的时间内就可以彻底地杀灭微生物，而泰能需要至少5h才可能杀灭微生物。这些结果也部分解释了为什么抗菌肽不容易导致微生物产生耐药。

由于其杀菌所需时间相当短暂，在这么短的时间内，微生物基本上来不及产生耐药;而抗生素需要的杀菌时间要长得多，微生物在长的作用时间内，很可能产生耐药机制。体内抗感染动物模型研究也表明，抗菌肽对于提高感染动物生存率的效果要明显地好于抗生素。无论是革兰阳性细菌还是革兰阴性细菌导致的微生物感染，抗菌肽的治疗效果都明显地好于抗生素(表4，5)。目前的工作改造了2个抗菌肽，在由37个氨基酸组成母体抗菌肽的基础上缩短为21和29个氨基酸，大大降低了生产成本;重要的是，改造的2个抗菌肽具有更好的抗菌效能。无论是毒性研究，还是体内外抗菌效果以及抗菌动力学研究都表明这些抗菌肽适宜作为临床用抗感染药物进行开发。为了全面的了解和评价这些抗菌肽，还需要进行大量的临床前工作，包括急性毒性、长期毒性以及体内药代动力学等实验。

作者：李崇阳陈梅梅张小琴单位：云南省第二医院肿瘤科中国药科大学生命科学与技术学院南京市宁海路社区卫生服务中心口腔科