浅谈酶联免疫法检测粮食中的呕吐毒素

摘 要：粮食中的呕吐毒素DON属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。因此，对于粮食中呕吐毒素含量的检测是相当重要的。检测方法主要包括气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、红外光谱分析、金标试纸法、荧光极荧光极性免疫分析性免疫分析以及酶联免疫法等。基于此，本文对酶联免疫法检测粮食中的呕吐毒素进行了较为系统的分析。

关键字：呕吐毒素；粮食；酶联免疫法

1. 前言

呕吐毒素(Vomitoxin)是近年来逐步引起人们重视的一种真菌毒素，其分布广，危害普遍，特别是伴随着谷物的生长过程而产生，不易预防。呕吐毒素化学名称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deox)nivalenol，DON)，属于单端孢霉烯族化合物，主要由某些镰刀菌产生(如F•graminearum，F•culmorum等)，因其能引起动物呕吐，故又称呕吐毒素(Vomitoxin)[1]。

DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。另外，它还常与其它的霉卤毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。DON属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。人畜摄入了被DON污染的食物/饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。我国谷物中DON 的限量标准为1.0 mg/kg [2]。

所以对食品当中呕吐毒素含量的检测是相当重要的。目前用于检测呕吐毒素的方法有很多，主要是要根据实验室的实际情况来选择测定方法。包括：气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、红外光谱分析、金标试纸法、荧光极荧光极性免疫分析性免疫分析以及酶联免疫法等。

2.实验

酶联免疫法（ELISA法）即酶联免疫吸附剂测定法的简称。其原理是①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度[3]。

ELISA测定法一般有三种竞争分析模式：包被特异性抗体直接竞争法、包被抗原直接竞争以及间接竞争法(也称为抑制性测定法)。间接竞争ELISA法的基本步骤是：包被完全抗原――同时加入已知抗体和待测抗原――加入酶标二抗――加入底物显色液。

2.1 试剂与设备

呕吐毒素ELESA快速检测试剂盒来自南昌博恒生物制品有限公司。

实验设备包括MK3酶标仪、粉碎机、分析天平、振荡器以及恒温培养箱。

2.2 测定过程[4]

2.2.1样品处理

假设测定的是玉米中的呕吐毒素，则应该首先准确称取5克粉碎均匀的玉米样至三角瓶中，加入25ml10%甲醇水（配比度为1+9）提取液，然后震荡10min，以定性滤纸快速过滤，收集滤液，最后取适当的滤液进行检测。

2.2.2抗原抗体反应

选择数孔DON-BSA板条，加入50lμl的DON系列标准溶液和处理好的待测样品提取液到各微孔中，再加入抗DON单克隆抗体50μl，37℃避光孵育1h。

2.2.3酶标二抗反应

将孵育后的板条取出，甩干，用洗涤液洗三次，没有连接的抗DON单克隆抗体在洗涤步骤中被除去，拍干。加入酶标二抗100μl，37℃避光孵育0.5h。

2.2.4显色

将孵育后的板条取出，甩干，洗涤液洗五次，拍干后各孔中加入100μl显色液，37℃的条件下显色5min。

2.2.5终止

每孔加入50μl终止液终止反应， 在酶标仪上读取450nm的吸光度。

2.2.6计算

用ELESA分析软件对数据进行分析计算。

2.3 实验分析 [5]

2.3.1最佳工作浓度的测定

当包被抗原DON-BSA的浓度为2μl/l，单抗的稀释度为1：25600时，ELISA检测的结果A450为1.172，故将包被抗原和单抗的最佳工作浓度分别确定为2ug／ml和1：25600。

2.3.2灵敏度的测定

方法的灵敏度是指测得DON标准溶液最低浓度的A值与0ug／L测得的A值之差>0．1读数，这个浓度就是最低检测浓度。试剂盒上面写着其最低检测限为0.2ppm，实验中测得的值为0.1993ppm，由此可知，该法的灵敏度较高。

2.3.3稳定性的测定

将标准品、抗原包被板、抗DON单克隆抗体、酶标二抗等本方法所有的试剂准备两套， 一套放入37℃环境下进行加速破坏性实验，每隔24h(37℃下24h相当于4℃下45d)进行一次测定。同时4℃冰箱保存一套。

实验结果显示：通过建立的ELISA间接竞争方法检测，置于37℃孵育箱中的试剂4d后其各浓度点的平均计数为4℃ 同时保存试剂的95．5％，剂量反应曲线与4℃保存的试剂结果相似，其RSD< 1O％，因此推算用该方法研制的试剂盒在4℃条件下可稳定6个月以上。显示方法稳定性良好

2.3.4加标回收实验

取一定量不含DON的啤酒样品，搅拌，除去过量的CO2(直至不产生明显的气泡)，静置后进行DON酶联免疫加标测定。分别测定含离子液体浓度分别为0和0.0149/ml两种体系中的回收率，重复测定7次。根据回收实验建立的标准曲线计算各自的DON浓度，扣去对照样品的浓度即为检测浓度。检测到的浓度与加标浓度之问的比率为对应的回收率。当体系中含有离子液体浓度为0.014g/ml时，其样品加标回收率为93.1％-98.6％，变异系数平均值为5.0％；当体系中不含该离子液体时，其样品加标回收率为85.7％-92.5％，变异系数平均值为8.9％。

多次试验表明，采用酶联免疫法测量呕吐毒素时，回收率高，稳定性及重现性较好，检测限宽。同时，检测过程反应灵敏，整个测定过程仅需2h。

3. 结论

酶联免疫吸附法(ELISA法)利用固相抗原(DON．BSA偶联物)和抗体(抗DON单克隆抗体)为反应原理，以酶标二抗作为控制抗体，进行DON的检测分析。其回收率高、灵敏度高、重现性好、测定时间短，且可以同时测定几十份样品，应用于粮食中呕吐毒素的测定能够大大提高工作效率。

参考文献

[1]刘绍伟，罗仕欢.浅谈霉菌呕吐毒素[J].湖南饲料，2006,2：26-29.

[2] baike.省略/view/2069891.htm

[3]袁克，龚燕，王俊双，孙秀兰.金标试纸法和酶联免疫法检测呕吐毒素的对比研究[J].安徽农业科学，2007,35（18）：5359-5360.

[4] 龚燕，孙秀兰，邵景东.酶联免疫法测定呕吐毒素的方法研究[J].食品科学，2007,28（10）：473-476.

[5]李鲁宁.硕士论文[D].离子液体介导的呕吐毒素酶联免疫检测方法的研究.