现代t在抗生素药品杂质分析中的应用研究

【摘要】目的：分析现代色谱及联用技术在分析抗生素药品杂质中的应用效果。方法 使用高相液相色谱―四级杆飞行时间质谱联用法检测羧苄西林钠原料药，分析羧苄西林钠的杂质成分。结果：共分析出10个杂质，3个为聚合物杂质，分别为二聚体1个、三聚体1个和6―氨基青霉烷酸与羧苄西林开环物的聚合物1个。结论：高相液相色谱―四级杆飞行时间质谱联用法分析羧苄西林钠原料药进行定性分析的效果好，可检出更多类型的杂质，检测结果可为控制羧苄西林钠高分子聚合物杂质含量提供参考。

【关键词】色谱;联用技术;抗生素;杂质

【Abstract】Objective The effect of the application of Modern Chromatography and combined technology in the analysis of the impurities in antibiotic drugs is analyzed.Method Using high phase liquid chromatography， the four stage of the flight time of the two groups was analyzed by the method of flight time of 9 rods， and the impurities were analyzed. The results showed that 3 impurities were divided into 1 groups： two，， 1 and 6.Result A total of 10 impurities were analyzed， and 3 were polymer impurities， which were divided into two groups of 1， 1 and 6 of the polymer.Conclusion High phase liquid chromatography and four bar flying time mass spectrometry were used to analyze the qualitative analysis of the raw materials， and the more impurity types could be detected， which could be used to provide a reference for controlling the impurity content of the polymer.

【Key words】Chromatography;Combined technology;antibiotic;impurity

羧苄西林钠是广谱青霉素类抗生素，羧苄西林钠主要通过抑制细胞壁合成发挥杀菌作用，具有无臭无味、对热不稳定和吸湿性强的特点。羧苄西林钠的过敏作用是的广大医学工作者关注的重点，也是世界性医学难题[1]。多数研究报道羧苄西林钠产生过敏的主要原因在于高分子聚合物杂质多，β―内酰胺换和原料在生产、存储和使用环节都可能混入杂质，形成二聚体、三聚体和四聚体等高聚物。因本文采用高相液相色谱―四级杆飞行时间质谱联用法分析羧苄西林钠原料药中的杂质成分，为生产、存储和使用羧苄西林钠提供指导，减少不良反应，提高药物的安全性。现报告如下：

1.实验部分

1.1实验试剂和仪器

实验试剂包括羧苄西林钠、乙腈、醋酸铵、水，羧苄西林钠由石药集团中诺药业（石家庄）有限公司生产，批准文号国药准字H13021987;乙腈及醋酸铵均为HPLC级;水由Millipore Milli-Q Gradient A10纯水仪制备。高效液相色谱仪为Agilent 1290型，四级杆飞行时间质谱联用仪为Agilent 6530型。

1.2实验条件

（1）HPLC-MS条件 使用色谱柱Agilent Poroshell EC C18柱（2.7μm，3.0mm×150mm），流动相A为5 mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为5 mmol/L醋酸铵乙腈溶液，柱温为35℃，波长254mm，流速0.3mL/min，进样量8μL，梯度洗脱时间分为0～21min，具体梯度脱洗时间见表1。电子喷雾离子源，采集模式为正离子模式，干燥气温度和气流速度分为为350℃和8L/min，雾化压力为45psi，传输电压120V，质子范围 50～1500m/z。

表1 梯度洗脱时间

1.3试品溶液制备

使用精密仪器称取适量羧苄西林钠，加入适量水，将羧苄西林钠稀释为1mg/mL溶液作为试品溶液。

2.结果

共分析出10个杂质，3个为聚合物杂质，分为二聚体1个、三聚体1个和6―氨基青霉烷酸与羧苄西林开环物的聚合物1个。

3.结果分析

羧苄西林钠的分子式为C17H16N2O6SNa2，工业生产中采用6―氨基青霉烷酸（6―APA）和苯丙二酸复合而成[2]。由于实验研究均认为杂质是导致羧苄西林钠产生过敏、神经系统反应、高钠和低钾血症、急性代谢性酸中毒、念珠菌二重感染的主要原因[3]，因此许多国家都非常重视分析羧苄西林钠的杂质成分，为指导生产、存储和使用羧苄西林钠过程减少杂质形成提供参考。

目前英国药典[4]采用HPLC梯度洗脱系统测定羧苄西林钠的杂质成分，研究结果显示该检测方法检测出8个杂质的结构式，但是未对相对保留时间做出规定，也没有其它杂质对照品，因而色谱系统无法对杂质峰值进行指认;HPLC梯度洗脱系统测定时间达1h，测试时间长。此外，HPLC梯度洗脱系统无法检出致敏性高聚物杂质。其它相关研究[5-7]分别将反相高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、反相高效液相色谱―凝胶色谱串联法、高效毛细管电泳法等多种分析方法用于羧苄西林钠的杂质成分分析，以上方法均存在不同程度分析效果不佳、分离杂质类型少的缺点。而羧苄西林钠的杂质属于高聚物杂质，对分析效果的要求更高[8]。因此，本研究采用高相液相色谱―四级杆飞行时间质谱联用法分析羧苄西林钠原料药。

对羧苄西林钠的主成分分析发现，主成分液相色谱图呈两个色谱峰，两色谱峰[M+H]+均为379.0956，结合主成分二级质谱图特点，色谱峰分别为羧苄西林R、S差异构体，既色谱系统可有效分离该两种立体异构体。同时，羧苄西林钠6―位侧链上的手性碳原子相连的氢原子的活性较强，易发生差相异构。但是立体化学异构体对疗效的影响作用极小，因而可判定为有效成分。

对羧苄西林钠杂质峰分析可以看到，同分子杂质以多个色谱峰形式出现。其中4个杂质峰[M+H]+均为397.1010，分子结构式为C17H30N2O7S，可判定杂质为羧苄西林开环物;从2号杂质2的提取离子流图可以看到，杂质的[M+H]+均为353.1159，分子结构式为C16H20N2O5S。对其二级质谱图信息可推测杂质为羧苄西林开环脱二羧基产物。3号杂质的离子流图可以看到，杂质3的杂质峰[M+H]+309.1265，分子组成是C15H20N2O3S，经二级质谱图分析初步推断杂质为羧苄西林开环脱二羧基产物。4号、5号、6号、7号杂质的离子流图分别显示杂质峰的[M+H]+分别为335.1053、217.036、367.1319、411.1216，分子组成式分别为C16H20N2O4S、C8H12N2O3S、C17H22N2O5S、C18H22N2O7S，结合各个杂质的二级质谱图，4号杂质推测为羧苄西林脱羧物，5号杂质推测为6―APA。6号杂质和7号杂质的结构还有待进一步确定，无法确定6、7号杂质类型。

在聚合物的MS结构解析中，试品溶液未发现高分子聚合物杂质，经试品溶液放于室温环境保存2周后在行HPLC-QTLF MS分析，结果显示主峰保留发现裂分峰，[M+H]+峰为595.1527，表明羧苄西林钠还存在8号杂质，根据杂质的二级质谱图，该杂质结构可能为6―APA与羧苄西林开环物缩合形成。该聚合物可以多个异构体的形式存在，故所得色谱峰为裂分峰。此外，试品溶液检测结果还显示出聚合物9号杂质和10号杂质，9号杂质的[M+H]+峰为731.2052，依据其二级质谱图，该杂质属于两分子羧苄西林开环物的二聚物。10号杂质属于高分子量聚合物，[M+H]+峰为1095.2804，初步推测为三分子羧苄西林开环物的三聚物。由于三聚物的聚合位点多，MS无法单独推测三聚物的结构。