生化综合实验项目的设计及应用

摘要 生物化学实验课程发展迅速并且渗透到生命科学的各个领域，在生物科学学科中的地位非常重要。其中DNA的提取、酶切及电泳就是典型的综合型实验，对学生的动手能力和发散思维的培养都有重要意义。通过对原有实验项目的优化和思路的创新，改进新的实验项目，增加了酶和质粒的理论知识和酶切的实验技术，使学生更加全面地学习和理解相关知识和实验操作。经过2次预做实验，对学生在实验中遇到的问题进行分析改进，为学生今后的进一步学习深造提供基础，为学有余力的学生提供更大的学习空间，真正地实现了师生间教学与科研的互动。

关键词 DNA提取；酶切；电泳；综合型实验；实验教学

中图分类号 G40 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）10-0328-02

随着社会现代化的发展，对于人才的要求也越来越丰富，不仅要具备扎实的理论基础，更要有熟练的动手能力和创造性思维。这就对各高校在学生的培养方面，提出了新的要求和期望。实验课程教学既能培养学生严谨求实的科学态度，独立探索知识的动手能力，又能使学生巩固和验证理论知识，是高等教育提高学生综合素养和实践能力的重要途径[1]。

生物化学是生命科学领域中一门重要的基础学科，生物化学实验课程既能让学生验证基本理论知识，又能掌握基本操作技术，为后续的专业课学习和应用打下了基础[2]。生物化学实验课程发展迅速并且渗透到生命科学的各个领域，以上海海洋大学为例，每年有14个专业20个班级的生物化学实验课程，是所有生物以及生物相关学科的专业基础课，在生物科学学科中的地位非常重要。

对于生物化学理论和实验课程的改革与探索一直在进行[3-4]，经多年努力，上海海洋大学的生物化学实验课程也形成了一套独具特色的体系，并获得了市级精品课程和优秀实验项目等荣誉。我校的生物化学实验课程由验证型实验和综合型实验两大类组成，涵盖了氨基酸、蛋白质、核酸和酶等生化理论知识。其中，大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳就是典型的综合型实验，对学生的动手能力和发散思维的培养都有重要意义。笔者作为生物化学实验室的专职实验员，结合学校教改项目，对大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳的试验项目进行了优化，使之更加紧密地与学生所学的理论知识相结合，更切合现代生化技术要求，为学生巩固所学知识以及以后的工作学习提供了扎实的理论和实践基础。

1 实验项目的优化

大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳的实验项目与生物化学理论课程中核酸的结构和基因工程章节密切相关，在理论知识学习过程中开展该实验，可以让学生积极地将理论与实际相结合，掌握核酸知识以及DNA提取和电泳的实验技术。该实验在上海海洋大学生化实验课程中已经开展多年，往年实验中学生对该实验理论知识掌握良好，动手操作能力也很娴熟。但是随着生化技术的突飞猛进，仅仅掌握好基础性理论和操作能力已经不能够适应学科的发展，越来越多的新兴技术应用于生物化学的研究中，为了使学生在今后的学习工作中能够更快更好的适应，应该在本科学习阶段就接触并了解一些新理论、新技术。

按照这一想法，将大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳实验项目做了改进和优化，增加了酶和质粒的理论知识和酶切的实验技术，使学生更加全面地学习和理解基因工程的相关知识。

2 实验思路的创新

原有的实验项目是将大肠杆菌的基因组DNA通过裂解、吸附、纯化等步骤提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA提取的结果。改进后的实验项目是提取大肠杆菌质粒DNA，并用2种不同的酶进行酶切，然后将提取的质粒DNA和酶切后的DN段一起进行琼脂糖凝胶电泳。表1中具体列出了原有实验项目和改进后实验项目中实验步骤的对比，比较分析了2个实验项目的差异。DNA的提取中原来是提取基因组DNA，现在改为质粒DNA提取，还是DNA的提取方法的实验，增加了对质粒的了解；酶切的实验从无到有，弥补了有关限制性内切酶的实验空白，通过酶切位点和质粒图谱对实验结果进行预测，充分发挥了学生的学习主动性以及问题的分析能力；电泳实验从原来的一个样（基因组DNA）增加到2个样（质粒DNA和酶切DN段），使得实验结果更丰富，学生对实验结果的分析更有内容。

3 实验预做

3.1 实验设计

结合实验室现有资源，选取已经导入pT2质粒的大肠杆菌作为实验对象，使用质粒抽提试剂盒提取质粒。提取的质粒在37 ℃孵育，分别加入Xho1和Sal1 2种限制性内切酶进行3 h的酶切。酶切过程中，配制琼脂糖凝胶，准备电泳，酶切结束后，将提取的质粒DNA和酶切的DN段以及maker在同一个凝胶中进行电泳。

3.2 实验结果

根据Xho1和Sal1 2种限制性内切酶的特异性酶切位点，环状质粒DNA将被切割成2条DN段，1条是491 bp的小片段，另1条是5 146 bp的稍大一些的DN段（图1）。这一预测和预做实验结果完全符合（图2）。预做实验成功，充分说明大肠杆菌质粒DNA的提取、酶切及电泳实验设计的合理性和可行性。

预做的实验是由实验教师和本专业研究生完成的（后称为第1次预做实验），为了进一步验证该实验方案的可行性，在2013―2014学年第2学期的生物化学试验课程中，选取2012级制药专业的学生，进行实验（后称为第2次预做实验）。实验方法和步骤，完全按照第1次预做实验的进行，实验结果见图3。可以看出，所有的同学都较好地从大肠杆菌基因组DNA中提取出了质粒DNA，电泳图谱清晰可见，但是酶切过程的实验结果不理想，酶切后的DN段不清晰，尤其是小片段，有些模糊不清，更或者有些同学的酶切片段和质粒DN段一样。

3.3 实验分析

比较第1次预做和第2次预做实验的结果，分析发现，造成酶切片段电泳结果不理想的原因可能有2个：一是因为质粒DNA总量过少。从图3可以看出，第2次预做实验的电泳图谱中质粒DNA的条带明显比第1次预做的亮度低，说明质粒DNA的总量较少，这就直接导致了酶切的DNA较少。选取的Xho1和Sa1Ⅰ 2种限制性内切酶使将环状质粒DNA酶切为一大一小2个片段，如果DNA总量少，酶切出的DN段就更少，进行电泳时小片段就更加难以辨别。二是酶切失败。图中有些同学的酶切片段和质粒DN段处在同一水平线上（图3），可见酶切过程对DNA完全没有影响，酶切失败。

3.4 实验改进

分析以上原因，我们认为在实验过程中要严格处理每一个步骤，养成学生严谨的试验态度，保证质粒提取过程中的总量，为后面的酶切过程提供充足的原料；其次在酶切过程中注意温度和时间的控制，保证酶切的必要条件。

在下个学期我们将继续选取1～2个班级开展该实验项目，对学生实验过程中出现的问题继续加以改进和优化，使之成为生物化学实验教学中一项固定实验项目。

4 结语

经过前期的实验设计和后期的学生预做环节，充分地验证了本实验的可行性，并且加强了学生对理论知识的理解和实验操作技能的掌握。试验项目内容不仅和基础实验知识相结合，还引进了现今国内外较成熟的科研实验技术，为学生今后的进一步学习深造提供了坚实的基础，为学有余力的学生提供更大的学习空间，真正实现了师生间教学与科研的互动，培养学生的科研思维，鼓励学生参与科研课题。

大肠杆菌质粒DNA的提取、酶切及电泳实验是生物化学实验教学中最具有综合性的一个实验项目，设立在实验课程最后的学习中，作为对生物化学理论知识的验证和加强，将生物化学理论课程中的知识加以巩固和学习，并大力拓展新的实验技能，对学生和老师都是一次新的学习和挑战。

5 参考文献

[1] 陈琼，程骏路.“微机原理与接口技术”综合实验项目的设计及应用[J].实验室研究与探索， 2013，32（11）：156-159.

[2] 王林玲，苗雪，龚娟娟，等.生物化学实验教学改革与大学生科研能力培养的探索[J].课程教育研究，2014（2）：166-167.

[3] 蒋霞云，李燕.高等农业院校生物化学双语教学的实践和探索[J].科技创新导报，2010（3）：247.

[4] 吴昊，朱正国，江敏.利用生化分析仪测水中氮、磷的教学实验研究[J].高校实验室工作研究，2013（3）：47-48.