子痫患者血清差异研究

本文作者：李 莉 丛 林 单位：安徽医科大学第一附属医院妇产科

妊娠期高血压疾病(pregnancyinducedhyper-tension)是妊娠期特有疾病，包括妊娠期高血压，子痫前期(轻度、重度)，子痫，慢性高血压并发子痫前期和妊娠合并慢性高血压。西方国家其发病率为7%～10%，我国发病率约为9．4%，多发生于妊娠20周以后至产后24h内［1］。多数病例妊娠期出现一过性的高血压、蛋白尿等症状，分娩后随即消失。病情严重者出现重度低蛋白血症、肝肾功能损害、胎盘早剥、HELLP综合征及子痫;此外，子宫血管痉挛引起胎盘供血不足、胎盘功能减退，导致胎儿宫内生长发育受限、胎儿窘迫、胎死宫内、死产或新生儿死亡，严重危害母婴健康［2］。由于其病因学不明，检测技术有限，目前尚无特异性血清标志物作为重度子痫前期筛查的指标。基于上述状况，我们设计了以筛选子痫前期重度患者和健康对照组孕妇血清标志物为目标的差异蛋白质组学研究。采用双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)分离子痫前期重度患者和健康对照组孕妇血清蛋白质，图像分析软件识别差异蛋白质点，应用电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOFMS/MS)鉴定两者的差异蛋白质，然后应用Westernblot检测差异蛋白质—P物质(substanceP，SP)在两者血清中的表达，进一步探讨P物质的临床应用价值。

1资料与方法

1．1一般资料病例组为安徽医科大学第一附属医院产科收治的8例子痫前期重度患者，年龄18～30岁，平均24岁，孕33～37周。8例患者中，初产妇5例，经产妇3例;均为单胎;均有不同程度的头昏、头痛、浮肿(+++～++++)，其中2例视物模糊;血压(165～190mmHg)∕(112～140mmHg)，尿蛋白(++～++++)，24h尿蛋白定量3．7～11．2g;2例胎盘早剥，1例HELLP综合征，这3例均伴有DIC。所有患者的诊断均符合《妇产科学》第7版［1］诊断标准，并排除影响血清蛋白质含量的其他相关疾病，如:妊娠合并慢性高血压、慢性肾炎、肾病综合征、胎膜早破、脑炎及其他血管性病变等。对照组为8例健康孕妇，其胎数、孕周及年龄与病例组相匹配，均无头昏、头痛、浮肿及视物模糊，血压及尿蛋白均正常。

1．2主要仪器及试剂低温高速离心机(Beckman)，水浴恒温振荡器(金华仪器)，紫外分光光度计(北京通用)，Mi-croQ-TOF质谱仪(Micromass)，PDquest二维凝胶图谱分析软件(Bio-Rad);尿素(urea)，硫脲(thiourea)，三羟甲基氨基甲烷［tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris］，赖氨酸(ly-sine)，银染试剂，辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG二抗及ECL发光剂等。

1．3方法

1．3．1样本收集和预处理采集病例组和对照组空腹静脉血4ml，室温下静置凝固30min，待血清析出，吸出血清以2000r/min、4℃离心10min，取上层血清，分装后置于－80℃冰箱中保存备用，至双向电泳前融化，避免反复冻融。取出血清样品，置冰盒上溶解。病例组8例各取50μl，等体积混匀，共400μl，分装为15μl/管及50μl/管备用;按上述方法预混8例对照组血清。采用试剂盒AlbuminandIgGRemovalkit(GEHealthcare)去除高丰度蛋白。

1．3．2蛋白浓度测定、双向凝胶电泳、银染采用GEHealthcare公司专门设计、针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提试剂盒，即2D-quantkit蛋白定量试剂盒。其基本原理是:将蛋白沉淀后，去除裂解液，再用含铜离子的溶液重溶蛋白质沉淀，未与蛋白质结合的铜离子可与显色工作液反应并显色，显色深浅与蛋白质浓度成反比。第一向固相pH梯度等电聚焦(IEF)，等电聚焦后迅速取出IPG胶条先后置于10ml平衡A液(6mol/LUrea、50mmol/LTris-HCLpH8．8、0．2%DTT、30%甘油、1%SDS、痕量溴酚蓝)和10ml平衡B液(6mol/LUrea、50mmol/LTris-HCLpH8．8、碘乙酰胺、30%甘油、1%SDS、痕量溴酚蓝)中，摇床上摇振，各平衡15min。将平衡后的胶条移至厚0．75mm、浓度为12．5%的PAGE分离胶上端，排净气泡后用溴酚蓝+0．5%琼脂糖封胶。将胶条包埋于二向胶中，加1×buffer电泳液，开始电泳。电泳条件:2．5W/胶电泳30min，然后以11W/胶恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处，停止电泳。完成后取出，银染。染色好的凝胶可暂时保存于超纯水中，待扫描。

1．3．3凝胶图像分析凝胶经Imagescanner扫描仪及Lab-Scan扫描软件扫描并获取图像(分辨率为300dpi，图像和凝胶大小比例为1∶1)，再用PDquest图像分析软件一次进行点检测、背景消减、标准化、匹配、建立平均凝胶、比较差异等分析，找出差异蛋白质点。

1．3．4质谱样品制备及分析由上海第二军医大学遗传教研室协助完成。

1．3．5数据库检索采用MicroMass公司的Mascot软件解谱ESI-Q-TOF质谱图，从原始MS-MS谱中产生PKL格式的数据文件。然后用MascotScience公司的站点查询数据库，取蛋白得分＞55分，置信水平95%。1．3．6Westernblot包括制胶，电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，ECL试剂发光、显影、定影等。

1．4生物信息学软件LabScan扫描软件，Pdquest二维凝胶图谱分析软件，MascotMS/MS数据库查询软件等生物信息学软件。

2结果

2．1血清双向凝胶电泳图谱和图像分析结果应用2-DE技术分离病例组和对照组孕妇血清总蛋白(上样量约120μg)，经银染后，得到双向凝胶电泳图谱。为保证结果的可靠性，相同条件下重复试验3次，每组各获得3张双向凝胶电泳图谱。采用PDquest双向凝胶电泳图像分析软件分析凝胶图谱，通过选择最弱点、最小点及最强点，自动过滤背景后，将识别获得的蛋白质点的面积、灰度等数据拟合成一张新的凝胶，在拟合凝胶图谱基础上匹配分析两组凝胶。结果显示:子痫前期重度患者血清图谱平均蛋白点数为219±5，健康孕妇血清图谱平均蛋白点数为213±8，匹配率为(97．2±1)%。与健康孕妇血清图谱比较，子痫前期重度患者血清图谱共有8个差异点。病例组中表达下调的点为1、2、3，其它点均表达上调，见图1。

2．2差异蛋白质点的鉴定从凝胶中切取8个差异蛋白质点，行ESI-Q-TOFMS/MS质谱分析，通过Mascot查询NCBI数据库，蛋白得分至少＞55分的结果才具有意义(P＜0．05)。结合双向凝胶电泳得到相应蛋白质点的表观分子量、等电点等可能的蛋白质信息。最终鉴定了3个蛋白质点，属于3种不同蛋白质，即凝血酶(thrombin)、P物质及血清白蛋白(albumin)。差异蛋白质的详细信息见表1。

2．3Westernblot检测血清中P物质表达情况2-DE联合质谱分离鉴定子痫前期重度患者和健康孕妇血清差异蛋白质的结果显示，病例组P物质表达水平明显低于对照组。提示P物质可能具有临床应用价值。为此，采用Westernblot检测两者血清中P物质表达，结果显示:病例组患者血清中P物质表达水平显著低于对照组(P＜0．05)，与质谱分析结果相同。见图2。

3讨论

双向凝胶电泳图谱及质谱分析结果显示，子痫前期重度患者血清中凝血酶、P物质及血清白蛋白表达均较健康孕妇下调，且以P物质表达差异最明显。提示P物质可能对该病的诊断具有一定意义，为揭示该病的发病机理提供了相应的依据。因为上述表达差异蛋白涵盖了急性期反应蛋白、凝血功能、补体调节、细胞外基质重构、运输蛋白等，均参与了重度子痫前期的发生发展。

3．1凝血酶它由凝血酶原在凝血因子Ⅹ和Ⅴ等共同作用下转变而成，是人体凝血功能的核心，具有诱导血小板集聚、激活蛋白C系统、反馈激活凝血因子生成更多的凝血酶等功能，通过引起血栓，达到止血目的，这对胎盘附着部位的止血有保护意义，但同时也使孕妇处于易发生血栓的高危状态。攻博等［3］研究提示，凝血酶生成活性随妊娠期高血压疾病病情的加重而上升，重度子痫前期尤为明显，但伴发DIC时，凝血酶生成明显低于其他各受检组，提示DIC发生后患者处于明显的低凝和纤溶活性相对低下的状态。本研究提示，病例组中凝血酶表达下调，与上述结果不尽相同，可能与所选患者病情严重且伴有凝血功能障碍有关。

3．2P物质SP是具有血管扩张作用的神经肽，其作为神经递质，参与神经调节，通过内分泌或旁分泌因子起作用，直接作用于血管平滑肌，引起血管舒张，血压降低［4］。目前研究认为，正常妊娠和妊娠期高血压疾病均存在炎症反应激活现象，妊娠期高血压疾病表现为过度激活。在炎症反应方面，SP起重要作用，参与多种炎症过程，包括中性粒细胞激活［5］、细胞因子生成及黏附分子上调等［6，7］;另外，SP还可激活肥大细胞，引起胞内钙离子动员和细胞脱颗粒，释放组胺［8］，加重炎症反应，导致炎症恶化［9］。妊娠期高血压疾病患者，机体失去代偿能力，SP抑制肾上腺髓质儿茶酚胺的合成与释放，对抗去甲肾上腺素引起的缩血管作用减弱;同时，SP促进前列腺素(PGE)和一氧化氮(NO)合成与释放的作用减弱［10］，血浆中PGE和NO等舒张血管的物质水平显著降低。妊娠期高血压疾病患者全身小动脉痉挛，血管缺血缺氧等变化使血浆中内皮素、血管紧张素等缩血管物质明显增加，血管收缩与舒张的调节处于失衡，加剧了血管痉挛，进而累及心、肝、肾、脑等重要脏器，影响胎儿-胎盘血液供应，产生高血压、水肿、蛋白尿、血液浓缩和胎儿生长发育迟缓等，甚至危及孕产妇及围产儿的生命。周丰等［11］的研究发现，正常妊娠期妇女血清SP低于非妊娠期妇女。罗湘闽等［12］的研究也发现，妊娠期高血压疾病患者血浆SP水平降低，随病情加重其下降程度愈显著，它可以反应妊娠期高血压疾病的病情发展变化。本研究也提示，子痫前期重度患者血清中SP表达下调。故作为生化指标，SP水平下降也有望成为重度子痫前期患者的诊断依据。

3．3白蛋白白蛋白是由肝脏合成的负性急性时相反应蛋白，约占血浆蛋白总量的40%～60%。发生损伤和炎症时，体内细胞释放某些生物活性介质，如白细胞介素、干扰素等，使肝脏合成白蛋白减少，导致血浆中白蛋白浓度下降［13］。妊娠期高血压疾病表现为炎症的过度激活，白蛋白合成进一步减少。另外，妊娠期高血压疾病基本的病理改变是全身小动脉痉挛，血管内皮细胞受损，通透性增加，白蛋白漏出增多。以上两方面综合所致血浆中白蛋白浓度明显下降。覃日吉等［14］研究提示，血浆白蛋白水平随妊娠期高血压疾病病情的加重呈下降趋势，重度子痫前期尤为明显。随着病情的不断发展，血压不断升高，大量白蛋白从尿中排出，导致血中白蛋白水平低下，产生低蛋白血症［15］。本文研究结果显示，病例组中血清白蛋白下调，与上述研究基本一致。综上所述，本研究采用蛋白质组学技术发现子痫前期重度患者血清中凝血酶、P物质及白蛋白的表达水平低于对照组，与以往研究不尽相同。本研究尚处初级阶段，未比较妊娠期高血压、子痫前期轻度、尤其是早发型先兆子痫患者中三种蛋白表达水平与健康对照组的差异，故上述差异蛋白还有继续研究的价值，以进一步分析、了解妊娠期高血压疾病的发生、发展机制，为其早期诊断提供新的思路。