细菌内毒素检查法与家兔法同步检测丹参川芎嗪注射液热原的比较

[摘要] 目的 考察细菌内毒素检查法和家兔法对丹参川芎嗪注射液检查的可行性。 方法 采用《中国药典》2010年版一部附录细菌内毒素检查法，对家兔试验进行比较试验。结果 丹参川芎嗪注射液稀释至160倍时，用灵敏度为0.06 EU/ml的鲎试剂进行实验，干扰消失。家兔热原检查法与细菌内毒素检查法相吻合。结论 采用细菌内毒素检查法和家兔检查法检测丹参川芎嗪注射液热原均可行。

[关键词] 丹参川芎嗪注射液；细菌内毒素；干扰试验；热原

[中图分类号] R927.12 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）12（c）-0101-03

丹参川芎嗪注射液为复方制剂，其组分为盐酸川芎嗪和丹参素。临床用于闭塞性脑血管疾病，如脑供血不足、脑血栓形成、脑栓塞及其他缺血性心血管疾病[1]。目前《中国药典》2010年版并未收录该品种，本品的现行标准是国家药品监督管理局国家药品标准（试行）WS-10001-（HD-1138）-2002，该标准规定了热原检查法，参照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅧB中药注射剂安全性检查法应用指导原则，该标准的热原检查剂量设计不符合《中国药典》规定，而且无细菌内毒素检查的规定。为此，本文对本品进行了细菌内毒素检查和热原检查的方法进行研究，报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

MS-1型旋涡振荡器（德国IKA）；SUB14型四孔水浴锅（英国GRANT）。

1.2 试剂

鲎试剂（TAL）：规格均为0.1 ml/支，湛江安度斯生物有限公司，批号为1109011和1305131，标示灵敏度分别为0.25 EU/ml和0.06 EU/ml；福州新北生物工业有限公司，批号为12020912和12070312，标示灵敏度（λ）分别为0.25 EU/ml和0.06 EU/ml。细菌内毒素工作标准品（CSE）：中国药品生物制品检定所，批号为150601-201174，规格 160 EU/支。细菌内毒素检查用水（BET水）：湛江安度斯生物有限公司，批号为 1109020，规格 50 ml/支。

1.3 试药

丹参川芎嗪注射液：贵州拜特制药有限公司生产，规格 5 ml/支，批号为20091003 001、20100502 002、20110303 002；万生联合制药有限公司生产，规格 5 ml/支，批号为20100601。

1.4 实验动物

取12只新西兰健康兔，体重2.0～3.0 kg，把家兔按体重均匀分成4组，每批3只。动物和饲料来源：广州花都信华实验动物养殖场，实验动物生产许可证编号SCXK（粤）2009-0023；动物饲养环境温度 20～25℃，湿度 40%～70%。

1.5 方法

1.5.1 鲎试剂标示灵敏度的复核

根据鲎试剂灵敏度的标示值，将以上各批鲎试剂用内毒素标准溶液进行灵敏度的复核[2]。

1.5.2 丹参川芎嗪注射液细菌内毒素限值（L）的确定

根据中国药典2010年版一部中细菌内毒素检查法的规定， L=K/M，L为供试品的细菌内毒素限值，K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5 EU/（kg·h），M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60 kg计算，注射时间若不足1 h，按1 h计算[2-4]。

根据产品的使用说明书（用法用量）中一般用法为5%葡萄糖注射液或生理盐水250～500 ml稀释，每次5～10 ml，故成人临床最大供试品剂量按10 ml计算，人均体重按60 kg计算，滴注时间按1 h计算，则M=10 ml/[60（kg·h）] =0.17 ml/（kg·h），L= K/M =5 EU/（kg·h） /0.17 ml/（kg·h）=30 EU/ml。考虑到老人安全用药，根据注射剂安全性检查法应用指导原则（修订稿），调整限值到计算限值的3倍，确定丹参川芎嗪注射液细菌内毒素限值为10 EU/ml。

1.5.3 丹参川芎嗪注射液的干扰预试验稀释倍数的确定

将样品使用市面上最大灵敏度0.5 EU/ml鲎试剂计算，MVD=λ/L，L=10 EU/ml。因此样品稀释倍数定为为20、40、80、160、320倍[2，4]。

1.5.4 干扰预试验

取4批丹参川芎嗪注射液，分别加BET水稀释至20、40、80、160、320倍，用酸度计测定pH值，均为6.6～7.0，符合细菌内毒素检查的pH值要求，稀释后样品为供试品管（NPC），将稀释液分别按1∶1比例加入0.5 EU/ml细菌内毒素标准溶液，为供试品阳性对照管（PPC）。使用两个厂家的鲎试剂（灵敏度为0.25 EU/ml）进行试验，同时使用检查用水和0.5 EU/ml细菌内毒素标准溶液作阳性对照（PC）和阴性对照（NC），每个浓度取2个平行管[2，4]。

1.5.5 正式干扰试验

用两个厂家（灵敏度为0.06 EU/ml，2批）的鲎试剂进行试验，取4批丹参川芎嗪注射液（批号：20100601，20091003 001，20100502 002，20110303 002）用内毒素检查用水将供试品分别稀释成160倍，按照1∶1比例分别加入2.0、1.0、0.5、0.25 λ细菌内毒素标准溶液。用BET水作鲎试剂复核。每个浓度取4个平行管。同时使用供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管。按照E= lg-1（∑X/4）计算。Es和Et分别为BET水和供试品稀释液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值[2，4]。

1.5.6 细菌内毒素检查法与家兔法的对比试验

1.5.6.1 丹参川芎嗪注射液热原限值的确定 根据中药注射剂安全性检查法应用指导原则中规定，热原检查限值根据临床剂量计算，一般为人用千克体重每小时最大供试品剂量的3～5倍，供试品注射体积每千克体重每小时体重一般≥0.5 ml，不超过10 ml[4]。根据上文1.5.2的使用说明书样品最大供试品剂量为10 ml，用千克体重每小时最大供试品剂量为0.17 ml，5倍量为0.8 ml。本次试验最终确定的限值为0.8 ml。

1.5.6.2 对比试验 使用灵敏度为0.06 EU/ml的两个厂家的鲎试剂，取4批丹参川芎嗪注射液，用BET水稀释至160倍进行内毒素检查，另外以细菌内毒素检查用水建立阳性对照和阴性对照。按《中国药典》2010年版一部细菌内毒素检查法检查，家兔法按原液给药，给药剂量为0.8 ml/（kg·h）[2，4-5]。

2 结果

2.1 鲎试剂标示灵敏度的复核

四批鲎试剂灵敏度分别为0.30、0.072、0.25、0.072 EU/ml，均在0.5～2.0 λ范围之间，符合规定，可用于细菌内毒素检查，具体结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果

2.2 干扰预试验

所用的4批丹参川芎嗪注射液稀释到160倍或以下浓度的溶液时，对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应无增强或抑制的干扰作用（表2）。

表2 干扰预试验结果

2.3 正式干扰试验

结果显示，NC均为阴性，无污染或增强干扰作用。含灵敏度为2 λ和0.25 λ内毒素标准溶液管结果分别为阳性和阴性，两批鲎试剂Es及4批丹参川芎嗪注射液Es均为0.5～2.0 λ， Et/Es均为0.5～2.0（表3）。由结果表明，丹参川芎嗪注射液在稀释160倍及以下浓度的溶液对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无增强或抑制的干扰作用，符合有关规定。因此确定丹参川芎嗪注射液的最大无干扰稀释倍数为160倍。

表3 正式干扰试验结果

2.4 细菌内毒素检查法与家兔法的对比试验结果

用细菌内毒素检查法和家兔法检查样品均符合规定，两种结果吻合（表4）。

3 讨论

细菌内毒素检查法是作为替代热原检查法的方法，在各国药典广泛使用，具有操作简单快速、灵敏度高、准确度高的优点，并符合3R原则，大大减少动物的消耗。进行细菌内毒素检查时，应先对具体品种的药品进行方法学的建立来评价样品对鲎试剂是否存在增强或抑制干扰现象，并确定无干扰浓度。供试品预干扰试验的目的是评价供试品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度[5]。本实验采用湛江安度斯生物有限公司和福州新北生物工业有限公司的鲎试剂对两个不同厂家共4个批号的样品进行试验，由干扰预试验结果可知，该样品在40倍及以上倍数有抑制干扰现象，稀释至160倍后，干扰现象消失。正式试验表明，4批丹参川芎嗪注射液Et/Es均为0.5～2.0，最大无干扰倍数为160倍。同时对比家兔法，结果两种方法结果均一致。实验表明，本品可按照《中国药典》2010年版二部进行细菌内毒素检查，内毒素限值定为10 EU/ml，应稀释至160倍或以下倍数。

有文献报道当丹参川芎嗪注射液稀释2倍后不产生干扰[6]，与本次试验的结果不一致。由于中药成分比较复杂，原料及提取工艺不同，干扰因素也存在变动，其中所含的鞣质、多糖等都有影响，这些可能是造成实验结果不同的原因[7]。而且本实验仅使用两个厂家的样品进行实验，样品批次较少。因此，建议收集多个厂家的样品进行细菌内毒素方法的进一步考察，研究代替热原检查法的可行性。

[参考文献]

[1] 李纪伟，信艳艳.丹参川芎嗪注射液的临床应用研究[J].哈尔滨医药，2011，（2）：133-135.

[2] 国家药典委员会.中国药典2010年版一部 [M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录85-88.

[3] 国家药典委员会.中国药典临床用药须知：化学药和生物制品卷（2005年版）[M].北京：人民卫生出版社，2005：168.

[4] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京.中国医药科技出版社， 2005：287-297.

[5] 陈琪，许姿敏.注射用盐酸胺碘酮细菌内毒素检查法[J].中国当代医药，2013，20（8）：72-75

[6] 王宗春，姜俊勇.丹参川芎嗪注射液细菌内毒素检查方法的研究[J].湖北中医药大学学报，2011，（13）：39-40.

[7] 范能全，彭兰.中药注射剂细菌内毒素检查方法的探讨[J].中国药房，2009，12（9）：1219-1221.

（收稿日期：2013-09-06 本文编辑：魏玉坡）