拉氧头孢钠的细菌内毒素检测

摘 要：目的：考察拉氧头孢钠细菌内毒素检查方法的可行性。方法：依据中华人民共和国药典（二部）2010年版附录ⅪE细菌内毒素检查法，确定拉氧头孢钠的有效稀释浓度和细菌内毒素检查限值。结果：拉氧头孢钠稀释为5mg/ml浓度时对细菌内毒素试验无，其细菌内毒素限值为0.05EU/mg时符合规定。可采用细菌内毒素检查法对本品进行质量控制。

关键词：拉氧头孢钠；细菌内毒素；干扰试验；鲎试剂

拉氧头孢钠是半合成的氧头孢烯类抗生素，抗菌性能与第三代头孢菌素相近，对多种革兰阴性菌有良好的抗菌作用。此外，由于该品的耐β-内酰胺酶的性能强，微生物对该品很少发生耐药性。细菌内毒素试验利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝聚反应的现象，来判断样品中细菌内毒素限量是否符合规定，具有简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。本文依据中华人民共和国药典（二部）2010年版附录ⅪE细菌内毒素检查法的要求，考察拉氧头孢钠细菌内毒素检查方法的可行性。

1材料与仪器

1.1试剂

鲎试剂：湛江安度斯生物技术有限公司生产，0.1ml/支，灵敏度：0.125EU/ml，批号：1105272；以上鲎试剂经山东睿鹰先锋制药有限公司微生物实验室复核，灵敏度符合规定，可用于细菌内毒素试验。

细菌内毒素工作标准品：中国药品生物制品检定所，120EU/支，批号：201072。

细菌内毒素检查用水：湛江安度斯生物技术有限公司生产，5ml/支，批号：1111280。

1.2样品

拉氧头孢钠，由山东睿鹰先锋制药有限公司生产，批号：201204106001、201204106002、201204106003。

1.3仪器

万分之一天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）、旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）、温度计、试管架、封口膜、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、玻璃移液管嘴、微量可调移液器、小试管、剪子等。所用热稳定性器皿应在电热干燥箱250℃干烤60分钟以去除可能存在的外源性内毒素。

2方法与结果

2.1干扰试验预试验

预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰试验提供依据。将供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD=CL/λ0.03

（1）干扰预试验供试液的制备：

称取适量拉氧头孢钠样品置玻璃试管中，用细菌内毒素检查用水1ml溶解制成含拉氧头孢100mg/ml的供试品原液。

按下式计算供试品最大有效稀释倍数MVD

MVD=C*L/λ

式中L为拉氧头孢钠细菌内毒素限值0.05EU/mg,C为供试品原液含拉氧头孢的浓度(mg/ml)，λ为凝胶法中鲎试剂的灵敏度标示值（EU/ml）

将含拉氧头孢浓度为100mg/ml的供试品原液用细菌内毒素检查用水依次稀释制成5倍稀释液、10倍稀释液(即浓度为10mg/ml)、20倍稀释液（即浓度为5mg/ml）、40倍稀释液（即浓度为2.5mg/ml）、80倍稀释液（即浓度为1.25mg/ml）、160倍稀释液（即浓度为0.625mg/ml）.

（2）细菌内毒素工作标准品的制备 将细菌内毒素工作标准品开启后加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，用封口膜封口，在旋涡混合器上混合15分钟制成120EU/ml的内毒素标准溶液。将标准溶液依次稀释制成4λ（0.5EU/ml）、2λ（0.25EU/ml）的细菌内毒素标准溶液（每一步稀释均不应超过10倍）：

（3）含标准内毒素浓度的供试品溶液的制备 取供试品5倍稀释液、10倍稀释液、20倍稀释液、40倍稀释液、80倍稀释液各0.2ml分别与0.5EU/ml（4λ）的内毒素标准溶液等量旋涡混合30秒，即得含标准内毒素0.25EU/ml（2λ）的供试品10倍稀释阳性对照液、20倍稀释阳性对照液、40倍稀释阳性对照液、80倍稀释阳性对照液、160倍稀释阳性对照液。

(4)准备鲎试剂

取规格为0.1ml/支的鲎试剂24支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开（防止玻璃屑落入瓶内），再插在试管浮板上，每支加入0.1ml细菌内毒素检查用水溶解，避免产生气泡。

（5）加样

鲎试剂溶解后，取10支分别加入含标准内毒素2λ的供试品10倍稀释阳性对照液、20倍稀释阳性对照液、40倍稀释阳性对照液、80倍稀释阳性对照液、160倍稀释阳性对照液各0.1ml，每浓度平行做2支；再取10支分别加入供试品10倍稀释液、20倍稀释液、40倍稀释液、80倍稀释液、160倍稀释液各0.1ml，每浓度平行做2支；2支分别加入2λ标准内毒素溶液各0.1ml做阳性对照；2支分别加入细菌内毒素检查用水0.1ml做阴性对照。

（6）孵育

加样结束后，用封口膜封口，用记号笔做上标记，轻轻混匀，连同试管浮板放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。保温和拿取试管过程应避免受到振动。

（7）观察结果

保温结束后，将试管连同浮板从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180度观察。管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；管内未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。

（8）统计试验结果

阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，试验有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数（即最大不干扰浓度）。

干扰预实验确定无干扰浓度后进行正式的干扰试验。供试品的最大不干扰浓度为5.0ml/mg。结果见表1。

表1干扰预试验结果

2.2干扰试验

在预试验的基础上（本次试验最大不干扰浓度为5mg/ml，选择5mg/ml的浓度做干扰试验）对3批供试品用鲎试剂进行正式的干扰试验。

（1）供试液的制备

称取3批拉氧头孢钠样品分别置玻璃试管中，用细菌内毒素检查用水1ml溶解制成含拉氧头孢100mg/ml的溶液。

(2)供试液的稀释

将浓度为100mg/ml的供试品原液用细菌内毒素检查用水依次稀释制成10倍稀释液、20倍稀释液。（即供试品浓度为5mg/ml）。

（3）内毒素标准溶液的制备

开启细菌内毒素工作标准品1支用1ml细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混合15分钟制成120EU/ml的标准溶液，将其依次稀释制成4λ、2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素标准溶液（每一步稀释均不应超过10倍）。

（4）含标准内毒素浓度的拉氧头孢钠供试品溶液制备

稀释内毒素标准品的同时分别取10倍3批供试品溶液与4.0λ、2.0λ、1.0λ、0.5λ内毒素标准溶液混合制成含标准细菌内毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25的供试品阳性对照系列溶液。

（5）准备鲎试剂

内毒素标准溶液制备好后，取鲎试剂72支。将鲎试剂分别按18支/组分成4组，并分别插在试管浮板上。

如下表所示：

注：样品为供试品溶液；水为细菌内毒素检查用水。

（6）加样

将鲎试剂开启后分别用0.1ml检查用水复溶，加样量均为0.1ml。

一组加检查用水稀释的内毒素标准溶液2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度每一浓度平行作4支，同时用细菌内毒素检查用水作2支阴性对照管。

三组分别加3批含拉氧头孢钠的内毒素标准溶液2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度每一浓度平行作4支，同时分别用3批拉氧头孢钠供试液作2支样品阴性对照管。

（6）孵育

加样结束后，用封口膜封口，用记号笔做上标记，轻轻混匀，垂直放入37℃水浴中，保温60分钟。

（7）观察结果

保温结束时将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180度，观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。

2.3试验结果

试验结果中最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验有效。Es在0.5λ～2.0λ范围内，且Et1、Et2、Et3均在0.5Es～2.0Es范围内，符合要求。

2.4结论

试验结果表明：用安度斯鲎试剂对拉氧头孢钠进行干扰试验。确认拉氧头孢钠的细菌内毒素检查在浓度为5mg/ml时无干扰，可以在不大于该试验的浓度下进行拉氧头孢钠的细菌内毒素检查。

参考文献：

[1]中国医药科技出版社，中华人民共和国药典，2010年版·二部，拉氧头孢钠，第449页；附录ⅪE:细菌内毒素检查法，附录99页.