细菌内毒素检测无法完全取代家兔热原法

关键词 细菌内毒素热原鲎试剂试验用家兔

在药品药理检测中，目前有两种常用的热原检测方法细菌内毒素法（鲎试剂法）和家兔法。虽然细菌内毒素检测法具有简便、快速、灵敏、重现性好等优点，且原来许多利用家兔热原检查法检测的药品均被细菌内毒素检查法所替代。但由于部分中药注射剂成分较复杂无法通过稀释法消除干扰，再加上鲎试剂对革兰阴性菌以外的内毒素不够灵敏，故细菌内毒素检测法无法完全取代家兔热原检测法。

概述

热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。通常所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及细菌内毒素。可见细菌内毒素是热原之一种。

细菌内毒素一般可分为外毒素和内毒素两类：外毒素是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质，产生外毒素的细菌主要是革兰阳性菌。内毒素是革兰阴性菌细胞壁的产物，一般活体细菌不会产生，只有当细菌死亡或黏附在其它细胞时，才会释放出内毒素，而脂多糖是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性。

热原按检查法可分为两种，一种是内毒素热原，是革兰阴性细菌细胞壁的组分；另一种是非内毒素热原，除内毒素外的热原。目前热原常用的检测方法主要是家兔法和细菌内毒素检测法（鲎试剂法）。热原检查法（家兔法）可用于检测上述两种原因产生的热原反应；细菌内毒素检查法只检测产品的细菌内毒素含量。当前医药工业中普遍接受的观点是：在生产质量管理规范（GMP）条件下控制内毒素污染就等于控制了热原污染，这也是内毒素检查法迅速普及的原因。

热原检查法

家兔热原检测法的建立：由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以半个世纪以来用家兔来检测热原，为保障药品质量和人类用药安全发挥了重要作用。目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。《中国药典》2010年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。家兔热原检测的优点是能够反映热原引起哺乳动物复杂的升温过程，该方法不但能检测出细菌内毒素的致热原，也能检测出非细菌内毒素的致热原，并且适用于检测较多种类的热原物质。

家兔法的发展和影响因素：影响家兔热原检测实验结果的因素很多，检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔热原检测法是以静脉注射供试品使家兔体温改变为基础。这就要求供试用的家兔精神、食欲、排泄等不得有异常，应健康合格。饲养合格家兔的动物室和试验室环境，其空气净化程度、换气次数、温湿度、沉降菌、照度、噪声等应符合国家《实验动物环境及设施》的要求。另一方面，试验人员的操作步骤要规范，操作技巧应娴熟，在进行试验时，严禁闲杂人员进入，更不得高声喧哗，给供试用家兔带来影响。因此，只有同时避免饲养环境、试验环境、试验人员的操作和家兔自身的因素等的影响，供试用家兔的体温才能保持稳定性和均一性，试验结果才能准确可靠。

由于我国中药品种较多，其成分含量复杂，无法排除细菌内毒素法中的干扰，必须使用家兔热原法进行检查。

细菌内毒素检测法（鲎试剂法）

细菌内毒素检测法的建立：1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又研究出微量革兰阴性菌内毒素遇鲎血液也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，目前已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。

细菌内毒素检测法的发展：在美国，鲎试验被称作“细菌内毒素试验（Bacterial Endotoxin Test）收载于1980年20版美国药典。随后英、德、意、日以及中国相继在药典中收载了这一检查法。2005年版《中国药典》规定168个品种进行细菌内毒素检查，到2010年版《中国药典》又新增修订细菌内毒素检查的品种达112种，共计270个品种。

《中国药典》2010年版规定的细菌内毒素检测法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）来表示。

细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素；后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。其中广泛使用，权威的检测方法为凝胶法。

鲎试剂法检查内毒素的灵敏度0.0001μg/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂。但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，再加上部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验。