谈药品细菌内毒素的定量测定

[摘 要]我国的医疗事业在高效发展，药品的质量一直都是人们关注的重点。在对药品细菌内毒素的定量测量方式来说，很多国家的药典中都有所涉及，其中以美国药典和英国药典为主。不仅如此，一些西方国家的药典中还涉及到关于药品细菌内毒素的测定形式。在进行定量测定的过程中，检验人员需要采用科学的方式来进行。本文中，笔者主要对药品细菌内毒素的定量测定方式进行深入介绍和分析，仅供参考。

[关键词]细菌内毒素；定量检测；常见问题

中图分类号：U284.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）01-0352-01

在对药品细菌的内定毒素进行检测的过程中，无论是国内还是在国外都普遍采用的方式就是注射剂，生物制剂等等检测方式。这种方式在现如今的医药研究领域中应用甚广，在检查的过程中存在着较多的影响因素。研究人员不仅要对药品细菌内毒素进行定量测定，还需要对相关的问题进行明确，并且提出相应的解决对策。

1、细菌内毒素测定原理

1.1浊度法原理

所谓的浊度法主要是对凝胶形成过程中出现的浊度变化情况进行分析和探讨，这种测定方式除了终点浊度法之外，还包括动态浊度法在其中。前者主要是对吸收度和透光率的变化状态进行确定。后者则是以对起浊时间进行判断。在测定的过程中，需要应用到检测器，光源以及分析仪等设备。

1.2显色基质法原理

这种方式在应用的过程中主要是对特殊底物释放的声色团进行测定，在连锁反应中生成凝固酶结构。通常情况下，特殊底物主要是由肽链以及COOH等成分相连接，释放的物质会经过耦合反应之后被测定。这种方式主要可以分为终点和动态显色基质等不同的方法。采用这一检测方式的过程中，工作人员往往会使用一种动态检测方式，主要是对反应物的颜色变化情况来进行测定。

2、实验过程

在本次实验中，实验人员主要以人血白蛋白中的细菌内毒素的含量为例进行测定。采用动态浊度法来进行实验，并且通过一定的干扰实验来对相关的浓度进行检测。在实验的过程中，工作人员对样品进行定量地检测，为以后的医药研究工作奠定基础。

2.1实验材料和仪器

在实验中，研究人员主要应用的实验材料为细菌内毒素检测用水、比浊法鲎试剂、细菌内毒素标准品以及康增液和人血白蛋白等等。这些实验材料都是经过专业的检测和审定，质量达标，可以应用到具体的时间当中。另外，实验所用的仪器主要以细菌内毒素检测仪为主。这一仪器设备主要是来自于北京科技有限公司。

2.2方法与结果

2.2.1细菌内毒素限制的确立。在这一过程中，实验研究人员主要是按照相关的实验准则来进行，一般情况下，人血白蛋白原液细菌的内毒素都具有标准的限制值。

2.2.2实验方法

首先，研究人员需要制作标准的曲线形式。具体来说就是按照细菌内毒素检测用水物质来对标准品进行检测，分别测定内毒素的浓度数值，然后在标准品中加入适当的鲎试剂，将其摇匀，然后插入检测仪设备来进行检测。为了保证实验的精准性，在同一浓度范围的样品需要进行三次实验。同时还应该将不同的浓度试管进行比对分析。对于实验所得到的数据来说，需要按照统计学的标准来进行分析，并且设置标准曲线，同时根据反应时间的长短来提升曲线制定的科学性。其次，干扰实验、样品稀释倍数的计算。在实际的研究中，研究人员将人体血液的白蛋白配置成浓度不同的溶液。

2.2.3实验结果

4个浓度系列200、100、40、20mg/mL-1（稀释度分别为1、1/2、1/5、1/10）的溶液，每个浓度下分别取0.1mL样品加0.1mL鲎试剂作为样品检查。PPC中加入0.1mL含1.25EU/mL-1细菌内毒素的样品溶液，处在标准曲线的中点浓度。将溶液分别平行两组，插入EDS-99细菌内毒素检测仪内进行检测。见表1：

结果可见，人血白蛋白在100mg/mL-1浓度以下其干扰试验添加内毒素的回收率均在有效浓度范围50%～200%之间，浓度在40mg/mL-1时回收率为99.03%，因此我们选择此浓度检查。见表2：

结果分析：该试验标准曲线的相关系数，回收率以及阴性对照的内毒素含量均符合定量细菌内毒素检查法的要求，实验是有效的。所测样品的内毒素含量为0.539EU/mL-1。

再次，在使用抗增液前，本实验已先对检品作了干扰试验，而干扰试验表明检品有明显增强作用。

3、讨论

3.1采用定量法检查的结果表明这批人血白蛋白样品的内毒素含量低于《中国生物制品规程》中规定的人血白蛋白原液细菌内毒素限制值L=2EU/mL-1，可以判断这批人血白蛋白的输液反应和内毒素无关。

3.2细菌内毒素定量法检查能直观地反映待测样品中的内毒素含量的多少，过程清晰，方法比较简洁，而且查过程以及结果的处理完全通过仪器来执行，比较客观。虽然现国内外检测人血白蛋白的热原质试验大多仍采用家兔法或凝胶法，但只要在实验过程中采取相关的辅助措施，动态浊度定量法也能得出较理想的结果。

3.3本实验中使用了能够消除B-D-葡聚糖干扰的抗增液。据相关资料显示，人血白蛋白对细菌内毒素检查的干扰因素主要是B-葡聚糖的影响，其来源于真菌的细胞壁，当人体受到真菌感染时，其会进入血液，因而在用血液制备人血白蛋白时，存在着被B-葡聚糖污染的可能。再者鲎试剂中存在着一个非内毒素激活的G因子旁路反应（LAL-RM），而B-D-葡聚糖能激活G因子，从而使鲎试剂发生凝固。而抗增液含有能抑制或阻断鲎试剂旁路反应的浓度的真菌多糖，所以使用抗增液对样品处理，能抑制消除LAL-RM的干扰，有利于样品检测。

3.4干扰试验表明人血白蛋白从100mg/mL-1起，回收率均符合要求，但稀释为40mg/mL-1浓度时，回收率最好，表明干扰最小，故选择此稀释浓度作为检测浓度。从鲎试剂与内毒素反应的机理可知，内毒素并：不是唯一能使鲎试剂产生凝集反应的物质，类似葡聚糖的物质也能使鲎试剂产生凝集反应，通常称为旁路反应。

3.5抗增液是一种辅助剂，含有能抑制或阻断鲎试剂旁路反应浓度的真菌多糖，可以用于细菌内毒素检查时阻断葡聚糖的干扰。本研究中虽然采用了同体系的血浆溶液内毒素标准曲线排除了部分干扰因素，但是血液中各种各样的蛋白酶及其抑制物，仍可能会引起鲎试剂的旁路反应造成“假阳性”或者回收率偏高的结果，进而使定量测定的结果受到影响，本研究结果显示，使用血浆稀释液制备标准曲线，使用抗增液后测定血浆中内毒素的回收率处于药典规定的范围之内，且不同来源的人血浆制备的标准曲线具有较好的重现性。

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