压力负荷增加大鼠模型血浆内皮素水平的改变

[摘要] 目的:观察压力负荷增加对大鼠血浆内皮素水平的影响。方法:采用腹主动脉狭窄法所致压力负荷增加诱发大鼠左室肥厚模型,观察左室重量指数(LVMI),采用放射免疫分析法检测血浆内皮素水平。结果:LVMI模型组明显高于假手术组(P

[关键词] 慢性心力衰竭; 压力负荷; 内皮素; 大鼠

[中图分类号] R541.61; R542.2[文献标识码] A[文章编号] 1671-7562(2010)01-0029-04

doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2010.01.008

Changes of the plasma endothelin in rats with pressure overload

ZHANG Qun-yan, DONG Xiao-lei, GUO Jun-hao, ZHANG Yong-wen,

ZHAO Zhi-ming, CAI Hui

(Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing

Military Command, PLA, Nanjing 210002, China)

[Abstract] Objective: To observe the effects of pressure overload on level of plasma endothelin, and study the possible mechanism of left ventricular remodeling. Methods: left ventricular mass index(LVMI) and plasma endothelin were measured in the rat models with myocardial hypertrophy of chronic heart failure and pressure overload by abdominal aortic constriction by radioimmunoassay. Results: LVMI in the model group was obviously higher than that of the sham group(P

[Key words] chronic heart failure; pressure overload; endothelin; rats

心室重塑是导致心力衰竭(heart failure,HF)不断进展的病理生理学基础,HF时心室重塑的病理刺激主要来自两方面:一方面神经内分泌的过度激活,另一方面为血流动力学异常。研究发现,异常升高的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、去甲肾上腺素(NE)、醛固酮和内皮素(ET)等可直接作用于心肌,促进心肌肥厚、心肌细胞凋亡和间质纤维化[1]。ET是目前已知最强烈持久的血管收缩因子,不但直接刺激或激活多种激素和细胞因子,而且参与心血管疾病的病理生理过程[2]。作者通过观察压力负荷增加对大鼠血浆ET水平的影响,以探讨血浆ET在HF病理生理过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

动物:雄性SD大鼠20只,体重180~200 g;血浆ET放免药盒(总医院科技开发中心放射免疫所提供)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 参考Doering等[3]的方法,2%戊巴比妥钠40 mg•kg-1腹腔注射麻醉,固定,剃毛,常规消毒,分层打开腹腔,在左肾上缘分开后腹膜等软组织暴露腹主动脉,并在双肾动脉上方分离腹主动脉,用银夹造成腹主动脉狭窄(银夹内径0.7 mm),分层关闭腹腔。

1.2.2 实验分组 所有动物随机分为模型组和假手术组2组,均常规喂养。假手术组手术时只分离腹主动脉,不用银夹缩窄,余操作与模型组相同。手术8周后处死,计算左室重量指数(LVMI),利用光镜观察左室心肌病理形态。

1.3 观察指标

1.3.1 LVMI 左室与室间隔的重量(湿重)为左室重量,用上海精科天平厂生产的JA1003型电子天平称重。左室重量(mg)/体重(g)为LVMI(‰)。

1.3.2 左室心肌病理形态 常规石蜡切片采用HE染色,经过脱蜡、染色、脱水、二甲苯透明及中性树胶封固等步骤,在光镜下观察[4]。

1.3.3 血浆ET放免测定 腹主动脉取血2 ml,注入含10% EDTA二钠30 μl和抑肽酶40 μl的试管中,混匀,4 ℃ 3 000 r•min-1离心10 min,分离血浆。-70 ℃存放,测定前冷水中复融,再次4 ℃ 3 000 r•min-1离心5 min,取上清采用非平衡法测定[5]。将聚苯乙稀试管编号,经过加液程序后4 ℃ 3 500 r•min-1离心25 min,吸弃上清液,在γ计数器上测定沉淀cpm数。

1.4 统计学处理

定量资料以±s表示,用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理。模型组和假手术组之间比较采用t检验,P

2 结果

2.1 LVMI

压力负荷增加大鼠造模8周LVMI模型组(2.98±0.36)较假手术组(2.11±0.14)有显著升高(P

2.2 左室心肌HE染色结果

光镜下假手术组造模8周后左室心肌HE染色显示:心肌纤维排列整齐,心肌细胞大小正常;模型组造模8周后左室心肌HE染色发现:心肌纤维排列紊乱,细胞横径稍大(图1、2)。

2.3 血浆ET水平的改变

压力负荷增加大鼠各组血浆ET水平的改变见图3,模型组血浆ET水平较假手术组显著升高(P

3 讨论

ET是一族由血管内皮细胞、心肌、平滑肌等合成及分泌的含21个氨基酸的活性多肽,是目前已知最强烈持久的血管收缩因子,可使所有的动、静脉强烈收缩,其强度比AngⅡ强10倍,比NE强1 000倍,尤其是对冠状动脉的作用最强;另ET-1还具有刺激心肌细胞增生肥大和促进心脏纤维化等生物学效应[6]。生理条件下,低浓度的ET对维持血管张力和血压具有重要意义;在某些病理条件下,ET则过量释放[7]。如慢性心力衰竭(CHF)时心输出量下降,心室壁机械负荷过重,导致组织切应力改变,心肌受损部位周围神经内分泌激活和组织缺氧可使心肌细胞ET-1过度表达,不仅引起血管痉挛、心肌纤维化和心肌平滑肌细胞裂解与凋亡,同时可直接刺激或激活多种激素和细胞因子,共同参与CHF的病理生理过程[8]。

ET的释放受许多因素的调节,如缺氧、机械性应力、神经内分泌激素(如NE、AngⅡ)、细胞因子(包括转化生长因子-β和白介素-1β)等均可诱导ET-1的表达。HF时,血中ET-1水平明显升高,升高的程度与HF的严重程度呈正相关关系。随着年龄的增长,血浆ET-1活性水平随之上升,而有氧锻炼可降低血浆ET-1的活性[9]。最近研究发现,特异性ET-1基因敲除大鼠心肌细胞的凋亡增加,而ET-1可通过FasL/TNF信号通路削弱TNF介导的凋亡[10]。Khan等[11]的实验认为big-ET是进展期HF患者的独立预后因素;还有一些学者提出了不同意见,但大多数研究者已达成共识,认为ET-1是HF强烈的独立预后因素[12]。本研究通过腹主动脉缩窄法制作的大鼠模型,造模8周后LVMI模型组较假手术组有显著升高(P

由于ET在心血管系统中举足轻重的作用,近年来对ET的认识也逐渐深刻。研究发现ET-1即ETA和ETB对心脏的作用主要通过内皮素受体(endothelin receptor,ETR)介导,其中以ETA为主。人类ETA受体mRNA主要表达于血管平滑肌细胞,ETB受体mRNA大量表达于血管内皮细胞,也表达于主动脉、肺动脉和冠状动脉的血管平滑肌细胞。ETA受体选择性与ET-1结合,而ETB受体与ET的各种异构体均具有相同的亲和力,也称为非特异性受体[13]。由于ETR的分布具有组织特异性,所以它们发挥的功能也不尽相同,ETA受体主要介导心血管收缩作用,ETB受体通过释放舒张因子,如前列环素(PGI2)、一氧化氮(NO)而介导心血管舒张作用,ETB受体还有清除循环ET-1作用。最近研究发现,ET-1和ETR结合后通过一系列过程可激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK),使细胞生长、肥大,参与心肌重塑。而ET拮抗剂在慢性心力衰竭中的研究观察到波生坦可减轻HF病人的临床症状[14]。由于ET和ETB受体结合后可起到扩血管、增加NO和PGI2浓度、增强肺清除ETA等作用,所以选择性ETA受体拮抗剂可能比同时抑制ETA和ETB受体的拮抗剂更为有利[15]。

本实验运用光镜观察左室心肌HE染色结果,同时检测LVMI、血浆ET水平的改变,证实腹主动脉缩窄8周后大鼠心肌肥厚模型建立成功,符合针对CHF的病理生理改变的要求,为临床及基础研究提供新的思路。

[参考文献]

[1] VON-LUEDER T G, KJEKSHUS H, EDVARDSEN T, et al. Mechanisms of elevated plasma endothelin-1 in CHF: congestion increases pulmonary synthesis and secretion of endothelin-1[J]. Cardiovasc Res,2004,63(1):41-50.

[2] YAMAMOTO S, MATSUMOTO N, KANAZAWA M, et al. Different contributions of endothelin-A and endothelin-B receptors in postischemic cardiac dysfunction and norepinephrine overflow in rat hearts [J]. Circulation,2005,111(3):302-309.

[3] DOERING C W, JALIL J E, JANICKI J S, et al. Collagen network remodeling and diastolic stiffness of the rat left ventricle with pressure overload hypertrophy[J]. Cardiovasc Res,1998,22:686-694.

[4] HIGASHIYAMA H, SUGAI M, INOUE H, et al. Histopathological study of time course changes in inter-renal aortic banding-induced left ventricular hypertrophy of mice[J]. Int J Exp Path, 2007,88(1):31-38.

[5] BREDIN F, FRANCO-CERECEDA A. Reversed remodeling in dilated cardiomyopathy by passive containment surgery is associated with decreased circulating levels of endothelin-1[J]. Eur J Cardiothoracic Surg,2006,29(3):299-303.

[6] CLOZEL M, SALLOUKH H. Role of endothelin in fibrosis and antifibrotic potential of bosentan[J]. Ann Med,2005,37:2-12.

[7] 肖继明,陈锐华,徐军,等.急性心肌梗死患者血浆内皮素的动态变化及意义[J].医学研究生学报,2007,20(3):331-332.

[8] SHAH R. Endothelins in health and disease [J]. Eur J Inter Med,2007,18:272-282.

[9] van GUILDER G P, WESTBY C M, GREINER J J, et al. Endothelin-1 vasoconstrictor tone increases with age in healthy men but can be reduced by regular aerobic exercise[J]. Hypertension,2007,50:403-409.

[10] ZHAO X S, PAN W T, BEKEREDJIAN R, et al. Endogenous endothelin-1 is required for cardiomyocyte survival in vivo[J]. Circulation,2006,114:830-837.

[11] KHAN S Q, DHILLON O, STRUCK J, et al. C-terminal pro-endothelin-1 offers additional prognostic information in patients after acute myocardial infarction: leicester acute myocardial infarction peptide(LAMP) study[J].Am Heart J,2007,154:736-742.

[12] YIP H K, WU C J, CHANG H W, et al. Prognostic value of circulating levels of endothelin-1 in patients after acute myocardial infarction undergoing primary coronary angioplasty[J]. Chest,2005,127:1491-1497.

[13] LAFLAMME K, ROBERGE C J, GERMAIN L, et al. Tissue-engineered human vascular media with a functional endothelin system[J]. Circulation,2005,111(4):459-464.

[14] PACKER M, McMURRAY J, MASSIE B M, et al. Clinical effects of endothelin receptor antagonism with bosentan in patients with severe chronic heart failure: results of a pilot study[J]. J Card Fail,2005,11(1):12-20.

[15] COWBURNA P J, CLELANDB J G F, McDONAGH T A, et al. Comparison of selective ETA and ETB receptor antagonists in patients with chronic heart failure[J]. Eur J Heart Fail,2005,7:37-42.

[摘要] 目的:观察压力负荷增加对大鼠血浆内皮素水平的影响。方法:采用腹主动脉狭窄法所致压力负荷增加诱发大鼠左室肥厚模型,观察左室重量指数(LVMI),采用放射免疫分析法检测血浆内皮素水平。结果:LVMI模型组明显高于假手术组(P

[关键词] 慢性心力衰竭; 压力负荷; 内皮素; 大鼠

[中图分类号] R541.61; R542.2[文献标识码] A[文章编号] 1671-7562(2010)01-0029-04

doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2010.01.008

Changes of the plasma endothelin in rats with pressure overload

ZHANG Qun-yan, DONG Xiao-lei, GUO Jun-hao, ZHANG Yong-wen,

ZHAO Zhi-ming, CAI Hui

(Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing

Military Command, PLA, Nanjing 210002, China)

[Abstract] Objective: To observe the effects of pressure overload on level of plasma endothelin, and study the possible mechanism of left ventricular remodeling. Methods: left ventricular mass index(LVMI) and plasma endothelin were measured in the rat models with myocardial hypertrophy of chronic heart failure and pressure overload by abdominal aortic constriction by radioimmunoassay. Results: LVMI in the model group was obviously higher than that of the sham group(P

[Key words] chronic heart failure; pressure overload; endothelin; rats

心室重塑是导致心力衰竭(heart failure,HF)不断进展的病理生理学基础,HF时心室重塑的病理刺激主要来自两方面:一方面神经内分泌的过度激活,另一方面为血流动力学异常。研究发现,异常升高的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、去甲肾上腺素(NE)、醛固酮和内皮素(ET)等可直接作用于心肌,促进心肌肥厚、心肌细胞凋亡和间质纤维化[1]。ET是目前已知最强烈持久的血管收缩因子,不但直接刺激或激活多种激素和细胞因子,而且参与心血管疾病的病理生理过程[2]。作者通过观察压力负荷增加对大鼠血浆ET水平的影响,以探讨血浆ET在HF病理生理过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

动物:雄性SD大鼠20只,体重180~200 g;血浆ET放免药盒(总医院科技开发中心放射免疫所提供)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 参考Doering等[3]的方法,2%戊巴比妥钠40 mg•kg-1腹腔注射麻醉,固定,剃毛,常规消毒,分层打开腹腔,在左肾上缘分开后腹膜等软组织暴露腹主动脉,并在双肾动脉上方分离腹主动脉,用银夹造成腹主动脉狭窄(银夹内径0.7 mm),分层关闭腹腔。

1.2.2 实验分组 所有动物随机分为模型组和假手术组2组,均常规喂养。假手术组手术时只分离腹主动脉,不用银夹缩窄,余操作与模型组相同。手术8周后处死,计算左室重量指数(LVMI),利用光镜观察左室心肌病理形态。

1.3 观察指标

1.3.1 LVMI 左室与室间隔的重量(湿重)为左室重量,用上海精科天平厂生产的JA1003型电子天平称重。左室重量(mg)/体重(g)为LVMI(‰)。

1.3.2 左室心肌病理形态 常规石蜡切片采用HE染色,经过脱蜡、染色、脱水、二甲苯透明及中性树胶封固等步骤,在光镜下观察[4]。

1.3.3 血浆ET放免测定 腹主动脉取血2 ml,注入含10% EDTA二钠30 μl和抑肽酶40 μl的试管中,混匀,4 ℃ 3 000 r•min-1离心10 min,分离血浆。-70 ℃存放,测定前冷水中复融,再次4 ℃ 3 000 r•min-1离心5 min,取上清采用非平衡法测定[5]。将聚苯乙稀试管编号,经过加液程序后4 ℃ 3 500 r•min-1离心25 min,吸弃上清液,在γ计数器上测定沉淀cpm数。

1.4 统计学处理

定量资料以±s表示,用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理。模型组和假手术组之间比较采用t检验,P

2 结果

2.1 LVMI

压力负荷增加大鼠造模8周LVMI模型组(2.98±0.36)较假手术组(2.11±0.14)有显著升高(P

2.2 左室心肌HE染色结果

光镜下假手术组造模8周后左室心肌HE染色显示:心肌纤维排列整齐,心肌细胞大小正常;模型组造模8周后左室心肌HE染色发现:心肌纤维排列紊乱,细胞横径稍大(图1、2)。

2.3 血浆ET水平的改变

压力负荷增加大鼠各组血浆ET水平的改变见图3,模型组血浆ET水平较假手术组显著升高(P

3 讨论

ET是一族由血管内皮细胞、心肌、平滑肌等合成及分泌的含21个氨基酸的活性多肽,是目前已知最强烈持久的血管收缩因子,可使所有的动、静脉强烈收缩,其强度比AngⅡ强10倍,比NE强1 000倍,尤其是对冠状动脉的作用最强;另ET-1还具有刺激心肌细胞增生肥大和促进心脏纤维化等生物学效应[6]。生理条件下,低浓度的ET对维持血管张力和血压具有重要意义;在某些病理条件下,ET则过量释放[7]。如慢性心力衰竭(CHF)时心输出量下降,心室壁机械负荷过重,导致组织切应力改变,心肌受损部位周围神经内分泌激活和组织缺氧可使心肌细胞ET-1过度表达,不仅引起血管痉挛、心肌纤维化和心肌平滑肌细胞裂解与凋亡,同时可直接刺激或激活多种激素和细胞因子,共同参与CHF的病理生理过程[8]。

ET的释放受许多因素的调节,如缺氧、机械性应力、神经内分泌激素(如NE、AngⅡ)、细胞因子(包括转化生长因子-β和白介素-1β)等均可诱导ET-1的表达。HF时,血中ET-1水平明显升高,升高的程度与HF的严重程度呈正相关关系。随着年龄的增长,血浆ET-1活性水平随之上升,而有氧锻炼可降低血浆ET-1的活性[9]。最近研究发现,特异性ET-1基因敲除大鼠心肌细胞的凋亡增加,而ET-1可通过FasL/TNF信号通路削弱TNF介导的凋亡[10]。Khan等[11]的实验认为big-ET是进展期HF患者的独立预后因素;还有一些学者提出了不同意见,但大多数研究者已达成共识,认为ET-1是HF强烈的独立预后因素[12]。本研究通过腹主动脉缩窄法制作的大鼠模型,造模8周后LVMI模型组较假手术组有显著升高(P

由于ET在心血管系统中举足轻重的作用,近年来对ET的认识也逐渐深刻。研究发现ET-1即ETA和ETB对心脏的作用主要通过内皮素受体(endothelin receptor,ETR)介导,其中以ETA为主。人类ETA受体mRNA主要表达于血管平滑肌细胞,ETB受体mRNA大量表达于血管内皮细胞,也表达于主动脉、肺动脉和冠状动脉的血管平滑肌细胞。ETA受体选择性与ET-1结合,而ETB受体与ET的各种异构体均具有相同的亲和力,也称为非特异性受体[13]。由于ETR的分布具有组织特异性,所以它们发挥的功能也不尽相同,ETA受体主要介导心血管收缩作用,ETB受体通过释放舒张因子,如前列环素(PGI2)、一氧化氮(NO)而介导心血管舒张作用,ETB受体还有清除循环ET-1作用。最近研究发现,ET-1和ETR结合后通过一系列过程可激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK),使细胞生长、肥大,参与心肌重塑。而ET拮抗剂在慢性心力衰竭中的研究观察到波生坦可减轻HF病人的临床症状[14]。由于ET和ETB受体结合后可起到扩血管、增加NO和PGI2浓度、增强肺清除ETA等作用,所以选择性ETA受体拮抗剂可能比同时抑制ETA和ETB受体的拮抗剂更为有利[15]。

本实验运用光镜观察左室心肌HE染色结果,同时检测LVMI、血浆ET水平的改变,证实腹主动脉缩窄8周后大鼠心肌肥厚模型建立成功,符合针对CHF的病理生理改变的要求,为临床及基础研究提供新的思路。

[参考文献]

[1] VON-LUEDER T G, KJEKSHUS H, EDVARDSEN T, et al. Mechanisms of elevated plasma endothelin-1 in CHF: congestion increases pulmonary synthesis and secretion of endothelin-1[J]. Cardiovasc Res,2004,63(1):41-50.

[2] YAMAMOTO S, MATSUMOTO N, KANAZAWA M, et al. Different contributions of endothelin-A and endothelin-B receptors in postischemic cardiac dysfunction and norepinephrine overflow in rat hearts [J]. Circulation,2005,111(3):302-309.

[3] DOERING C W, JALIL J E, JANICKI J S, et al. Collagen network remodeling and diastolic stiffness of the rat left ventricle with pressure overload hypertrophy[J]. Cardiovasc Res,1998,22:686-694.

[4] HIGASHIYAMA H, SUGAI M, INOUE H, et al. Histopathological study of time course changes in inter-renal aortic banding-induced left ventricular hypertrophy of mice[J]. Int J Exp Path, 2007,88(1):31-38.

[5] BREDIN F, FRANCO-CERECEDA A. Reversed remodeling in dilated cardiomyopathy by passive containment surgery is associated with decreased circulating levels of endothelin-1[J]. Eur J Cardiothoracic Surg,2006,29(3):299-303.

[6] CLOZEL M, SALLOUKH H. Role of endothelin in fibrosis and antifibrotic potential of bosentan[J]. Ann Med,2005,37:2-12.

[7] 肖继明,陈锐华,徐军,等.急性心肌梗死患者血浆内皮素的动态变化及意义[J].医学研究生学报,2007,20(3):331-332.

[8] SHAH R. Endothelins in health and disease [J]. Eur J Inter Med,2007,18:272-282.

[9] van GUILDER G P, WESTBY C M, GREINER J J, et al. Endothelin-1 vasoconstrictor tone increases with age in healthy men but can be reduced by regular aerobic exercise[J]. Hypertension,2007,50:403-409.

[10] ZHAO X S, PAN W T, BEKEREDJIAN R, et al. Endogenous endothelin-1 is required for cardiomyocyte survival in vivo[J]. Circulation,2006,114:830-837.

[11] KHAN S Q, DHILLON O, STRUCK J, et al. C-terminal pro-endothelin-1 offers additional prognostic information in patients after acute myocardial infarction: leicester acute myocardial infarction peptide(LAMP) study[J].Am Heart J,2007,154:736-742.

[12] YIP H K, WU C J, CHANG H W, et al. Prognostic value of circulating levels of endothelin-1 in patients after acute myocardial infarction undergoing primary coronary angioplasty[J]. Chest,2005,127:1491-1497.

[13] LAFLAMME K, ROBERGE C J, GERMAIN L, et al. Tissue-engineered human vascular media with a functional endothelin system[J]. Circulation,2005,111(4):459-464.

[14] PACKER M, McMURRAY J, MASSIE B M, et al. Clinical effects of endothelin receptor antagonism with bosentan in patients with severe chronic heart failure: results of a pilot study[J]. J Card Fail,2005,11(1):12-20.

[15] COWBURNA P J, CLELANDB J G F, McDONAGH T A, et al. Comparison of selective ETA and ETB receptor antagonists in patients with chronic heart failure[J]. Eur J Heart Fail,2005,7:37-42.