2型糖尿病大鼠肝脏损伤与固醇调节元件结合蛋白—1c、c—Jun氨基末端激酶表达的关系

[摘要] 目的 探讨固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）在2型糖尿病大鼠肝损伤中的表达和意义。 方法 高脂饲料喂养结合小剂量链脲菌素建立2型糖尿病伴肝损伤大鼠模型组，同时以普食喂养的大鼠作为对照组，检测两组大鼠血糖、血脂水平，同时检测SREBP-1c及JNK的蛋白表达水平，观察大鼠肝损伤与SREBP-1c及JNK蛋白表达水平之间的关系。 结果 模型组血糖及血脂水平明显高于对照组，模型组肝功能生化指标检测显示损伤明显，模型组与对照组差异有统计学意义（P < 0.05）；模型组SREBP-1c蛋白表达阳性着色区域积分吸光度值为（51 767.21±3 246.37），JNK阳性表达率为90.9%；对照组阳性着色区域积分吸光度值为（35 814.37±2 971.52），JNK阳性表达率为31.6%，两组差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 模型组大鼠SREBP-1c与JNK蛋白表达水平明显高于对照组，2型糖尿病伴肝损伤大鼠的SREBP-1c和JNK蛋白表达明显增加。

[关键词] 2型糖尿病；固醇调节元件结合蛋白；c-Jun氨基末端激酶；肝损伤

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（b）-0019-03

糖尿病常分为1型与2型，其中2型糖尿病较易引起各类并发症，如视网膜病变、神经病变、酮症酸中毒及肝损伤等，其中肝损伤较为凶险，且肝损伤与糖尿病互相影响形成恶性循环，糖尿病导致糖、脂代谢紊乱，进而引起糖原和脂质在肝细胞堆积及肝微血管病变，其中以脂肪肝和肝硬化较为常见[1]。本文为了探讨2型糖尿病伴肝损伤的临床诊断指标，将2型糖尿病伴肝损伤大鼠作为研究对象，观察肝损害与SREBP-1c、JNK蛋白表达水平之间的相关性[2-3]。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，大鼠血糖平均值为（4.41±0.59）mmol/L，平均（4.6±0.2）周龄，平均体重（86.7±5.2）g；所有大鼠试验前均饲以普通饲料，单笼喂养，自由摄食摄水。将60只SD大鼠随机分为模型组和对照组，模型组40只，对照组20只。

1.2 制备动物模型

参照相关2型糖尿病大鼠造模方法，模型组大鼠给予高脂饮食，对照组给予普通饮食，均饲养4周。模型组大鼠形成肥胖性胰岛素抵抗状态，禁食12 h，用pH= 4的1 mmol/L无菌PBS缓冲液将STZ配制成1%溶液，按30 mg/kg的剂量腹腔注射2次/d，共注射2 d，注射完成后再禁食12 h，两组大鼠继续饲养2周。2型糖尿病大鼠模型是否建立成功，以空腹血糖≥ 9 mmol/L确定，伴肝损伤大鼠模型建立以检测肝功能指标确定。本文造模结束时共得到2型糖尿病大鼠32只，2型糖尿病伴肝损伤大鼠25只。两组大鼠乙醚麻醉后眼静脉丛取血，测定血糖、血胰岛素、血三酰甘油、胆固醇及肝功能指标[4]，处死后取出肝脏置于10%甲醛溶液中固定，制作石蜡切片[5]。

1.3 SREBP-1c与JNK检测

采用免疫组织化学法检测SREBP-1c蛋白表达，以PBS作阴性对照，大鼠肝组织石蜡切片常规脱蜡至水后置于2%过氧化氢甲醇溶液中，37℃孵育20 min，滴加一抗和二抗4℃过夜，室温孵育30 min后显色；检测结果以阳性面积和染色深度计算阳性积分吸光度值。检测JNK蛋白表达采用免疫组化染色方法，对照组和模型组大鼠肝组织进行免疫组化染色[6]，按照试剂盒要求操作，以PBS为阴性对照，根据染色强度和阳性细胞百分比综合评价JNK阳性百分表达率。

1.4 血生化指标检测

两组大鼠均以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，下腔静脉取血5 mL加入肝素抗凝管内，室温下待自然凝固后以1 500 r/min离心15 min后，分离血清后于-30℃低温保存备用。血清葡萄糖水平检测中血清葡萄糖（GLU）检测采用己糖激酶法（HK），血清胰岛素（INS）检测采用酶联免疫法（EIA），HK试剂盒与双抗体夹心酶联免疫吸附实验试剂盒均购自上海研谨生物科技有限公司；血脂检测中血三酰甘油（TG）试剂盒、游离脂肪酸（FFAs）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）试剂盒、总胆固醇（TC）试剂盒均购自厦门慧嘉生物科技有限公司，以上血脂水平检测均采用酶比色法测定；肝功能检测中丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、总胆红素（TBiL）试剂盒、白蛋白（Alb）试剂盒、透明质酸酶（HA）试剂盒和层黏蛋白（LN）试剂盒购自湖南永和阳光科技有限责任公司，其中ALT、AST检测采用酶速率法，TBiL、Alb、HA及LN检测采用重氮终点法；以上各项生化指标检测均采用BT-2245全自动生化分析仪进行检测。

1.5 统计学方法

将各检测资料建立数据库，所有数据采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血糖及血脂水平对比

两组大鼠的血糖和血脂水平从表1中可见，模型组体重、肝重及肝重占体重比例明显大于对照组；模型组血糖及血脂水平也显著高于对照组，两组间差异有统计学意义（P < 0.05），说明模型组大鼠具有明显的2型糖尿病伴肝损伤症状。

2.2 肝功能指标比较

通过检测ALT、AST、TBiL及Alb的血清含量，可作为评价肝功能损伤情况的指标，同时检测HA和LN，可作为评价肝硬化情况的指标。具体检测对比结果从表2中可见，模型组各项评价指标均差于对照组，两组间差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 SREBP-1c与JNK表达水平对比

两组SREBP-1c与JNK蛋白表达水平从表3中可见，模型组两种因子表达水平均高于对照组，两组差异有统计学意义（P < 0.05），由此可见，2型糖尿病伴肝损伤大鼠的肝组织SREBP-1c与JNK蛋白表达增强与肝损伤相关。

表3 SREBP-1c与JNK表达水平对比

3 讨论

2型糖尿病患者分泌胰岛素的能力并非完全丧失，有的甚至会分泌过多的胰岛素，但胰岛素敏感度却明显降低，患者体内胰岛素处于相对缺乏状态，胰岛素分泌不足或作用缺陷导致糖、脂肪和蛋白质代谢异常。糖代谢紊乱引起的高血糖症会使糖原在肝组织堆积，导致肝微血管病理性损伤，脂肪代谢紊乱使游离脂肪酸过多进入肝组织，当超出肝脏清除能力时，形成脂肪肝或肝硬化等症状，因此临床上常见由糖尿病引起的肝损伤，这也成为我国危害人体健康的主要肝病之一[7-9]。本文为探寻2型糖尿病伴肝损伤的临床诊断指标，建立了2型糖尿病伴肝损伤大鼠模型，参考国内外文献和研究，通过观察大鼠肝损害情况和SREBP-1c及JNK蛋白表达水平，分析二者之间的关系。

1993年人们首次从细胞核中抽取纯化出固醇调节元件结合蛋白（SREBP），该蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸链转录因子，参与脂质和糖类的代谢，进一步研究发现其有3类异构体，分别为SREBP-1a、SREBP-1c及SREBP-2，每类异构体在体内分布不同且由不同启动子转录产生，故而在体内的蛋白表达部位有较大差异，其中SREBP-1c在人和鼠组织表达部位相近，尤其在肝脏中有高水平表达。SREBP-1c通过HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶及脂肪酸合酶等表达基因，调控胆固醇、三酰甘油等脂质的合成与吸收，在脂肪肝的形成中起到至关重要的作用[10]，但SREBP-1c属于无活性前途蛋白，在肝组织内调控脂质需要进一步转录活化，目前能确定多个因子参与其活化过程，其中胰岛素和胰高血糖素是较强的活化因子，其能促进SREBP-1c在肝组织中表达增加，导致肝组织脂质堆积造成肝损伤。因此检测SREBP-1c在肝组织中的蛋白表达水平能评价肝损伤情况。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）中的重要成员之一，JNK蛋白激酶有JNK1、JNK2 和 JNK3三种基因编码，在人体各种组织器官中普遍存在，如果JNK长期处于活化状态会使细胞凋亡，当肝组织中JNK长期处于活化状态，必定会使肝细胞凋亡而造成肝损伤[11]。另外，健康人体的胰岛素结合胰岛素受体，受体底物又酪氨酸磷酸化发挥作用，JNK高表达会提高胰岛素受体底物的丝氨酸磷酸化比例，酪氨酸磷酸化比例相应的降低，细胞内胰岛素信号传导受阻，肝脏胰岛素抵抗从而形成。因此检测肝组织JNK蛋白表达水平能评价肝损害情况，本文通过检测SREBP-1c和JNK蛋白表达水平，发现其表达水平与肝损伤有较大的相关性。

[参考文献]

[1] 刘亚军，王佳，王春生.加味四逆散治疗2型糖尿病脂肪肝肝损害临床观察[J].北京中医药，2009，28（7）：530-531.

[2] 黄坤，胡瑾华，许执恒，等.c-Jun氨基末端激酶在D-半乳糖胺/脂多糖诱导急性肝衰竭小鼠肝组织中的表达及意义[J].中华临床医师杂志，2011，5（9）：2518-2521.

[3] 刘栩晗，李国生，黄澜，等.黄连素对2型糖尿病中国地鼠肝脏固醇调节元件结合蛋白转录调节系统表达的影响[J].大连医科大学学报，2011，33（1）：23-30.

[4] 蒙延胜，张兵，赵英梅，等.2型糖尿病胰岛素抵抗与多项血清因子水平的相关性分析[J].中国医药导报，2011，8（5）：159-160.

[5] Miyauchi K，Takiyama Y，Honjyo J，et al. Upregulated IL-18 expression in type 2 diabetic subjects with nephropathy：TGF-beta1 enhanced IL-18 expression in human renal proximal tubular epithelial cells [J]. Diabetes Res Clin Pract，2009，83（2）：190-199.

[6] 郝军，刘淑霞，韦金英，等.高脂喂养大鼠肾小管上皮细SREBP-1、TGF-β1、α-SMA的表达和细胞外基质沉积[J].中国应用生理学杂志，2012，26（3）：307-311.

[7] Menendez JA，Vazquez MA，Ortega FJ，et al. Fatty acid synthase：association with insulin resistance，type 2 diabetes and cancer [J]. Clin Chem，2009，55（3）：425-438.

[8] 亓晓晶.胰激肽原酶对2型糖尿病肾病的影响[J].中国医药，2006，1（1）：38-39.

[9] 张淑群，耿坤，曹志贤.某区居民2型糖尿病现状调查与干预对策[J].护理实践与研究，2012，9（21）：4-7.

[10] 罗贤波.61例2型糖尿病患者血脂水平分析[J].中国医药导报，2009，6（21）：166-167.

[11] 陈金虎，刘慧霞，张佳妮，等.c- jun氨基末端激酶在非酒精性脂肪肝病胰岛素抵抗大鼠中的表达及意义[J].中国现代医学杂志，2009，19（12）：1782-1789.

（收稿日期：2012-11-29 本文编辑：郝明明）