应用IC—RT—PCR法检测怀地黄中烟草花叶病毒(TMV)

[摘要] 目的：建立一套快速、灵敏、高效的怀地黄TMV检测技术，为怀地黄TMV的脱毒检测提供技术支持，以实现怀地黄脱毒苗的产业化生产，改善病毒病引起的品种退化现象。方法：根据GenBank上登录的TMV外壳蛋白基因保守序列，设计特异性引物，利用免疫捕捉RT-PCR（IC-RT-PCR）技术检测怀地黄中的TMV，并对PCR扩增产物进行测序。结果：利用IC-RT-PCR技术扩增出了预期目的条带，其扩增产物与地黄TMV CP基因（登录号为AY555269）核苷酸序列的同源性达95.29%，氨基酸同源性达96.7%。结论：建立了怀地黄TMV的IC-RT-PCR检测技术，集免疫学与分子生物学检测技术于一体，灵敏度高，操作简便，适合于怀地黄TMV的快速检测。

[关键词] 怀地黄；TMV；IC-RT-PCR；序列分析；病毒检测

植物病毒是仅次于真菌的一类病原物，由于病毒对寄主的绝对寄生性，使得其危害很大，同时防治又很困难，故病毒病有植物癌症之称。怀地黄Rehmannia glutinosa f. hueichingensis （Chan et Sehih） Hsiao为玄参科地黄属多年生草本植物，其根可入药，是我国著名的“四大怀药”之一。因在生产中长期采用营养繁殖，易受多种病害尤其是病毒害的侵袭，通常田间病毒感染率达100%，导致其品质及产量严重下降，栽培上称之为“品种退化”[1]。因此，对于地黄病毒病和脱毒快繁技术的研究也很多。1962年田波等首先分离到地黄退化病毒（DDV），鉴定为烟草花叶组（tobamovirus）成员[2]。2004年张振臣等利用血清学和RT-PCR技术对河南省地黄病毒病进行了鉴定，结果表明感染病毒的种类包括TMV，BBWV（蚕豆萎蔫病毒），CIRV（康乃馨意大利环斑病毒），CMV，对田间感病进行间接ELISA检测，发现TMV感病率最高，达100%，说明TMV为侵染地黄的主要病毒[3]。目前认为最为有效的防治地黄病毒病的办法就是脱毒培养，因此就需要有一套快速、高效、灵敏的检测技术对茎尖种苗进行脱毒检测。免疫捕捉PCR技术（IC-RT-PCR）是一种RT-PCR与ELISA相结合的检测方法，与常规RT-PCR检测相比，它避免了RNA提取过程中造成的损失和污染，提高了检测的灵敏度和特异性[4]。本文建立了IC-RT-PCR技术检测怀地黄中TMV的方法，为怀地黄脱毒种苗的生产提供技术支持。

1 材料

阳性材料来源于温县农科所试验田感病怀地黄，检测材料为本实验室经过脱毒处理的怀地黄无菌苗。

禽源反转录酶（AMV）购于美国Promega公司；Taq DNA聚合酶、dNTP等分子生物学试剂均购于Takara宝生物工程有限公司；TMV抗体由河南省农业科学研究院植物保护研究所张振臣研究员惠赠。

2 方法

2.1 引物设计 根据GenBank中已登录的TMV CP基因的核苷酸序列（登录号为AY555269）设计TMV引物，由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物P1：5′-CCATCCCAGTTCGTGTATTTGTC-3′；下游引物P2：5′-TTCAGCAGTTGTAGGGTTCGC-3′。

2.2 捕捉抗原 将病毒的抗体按1∶1 000 （约5 mg·L-1）的工作浓度用包被缓冲液（Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，NaN3 0.2 g，加蒸馏水至1 L）稀释，混匀后取100 μL加入灭菌的0.2 mL的薄壁PCR管中，37 ℃孵育2 h或者4 ℃过夜。加200 μL的洗涤缓冲液（10 mmol·L-1，pH 7.5，Tris-HCl；150 mmol·L-1 NaCl；0.05%聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯Tween-20），静置3 min后倒掉，洗管3次，甩干溶液，置于冰上。取新鲜叶片，按1∶5的稀释度用提取缓冲液（500 mmol·L-1，pH 8.2，Tris-HCl；150 mmol·L-1 NaCl；2% PVP；0.05%聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯Tween-20）研磨。4 ℃，10 000 r·min-1离心15 min。取100 μL上清液加入上述管中，37 ℃孵育2 h或者4 ℃过夜。洗管3次。RNA的释放：在上述管中加入20 μL的释放缓冲液（4 μL 5×RT buffer，2 μL 10 mmol·L-1 dNTP，14 μL ddH2O，0.2 μL TritonX-100），65 ℃水浴10 min，置于冰上。

2.3 RT-PCR 在上述管中加入10 mmol·L-1的P2引物1 μL，88 ℃变性5 min，立即置于冰上。然后加入AMV反转录酶（10 U·μL）0.3 μL，42 ℃温浴1 h。4 ℃备用。新取0.2 mL PCR扩增管，加入下列反应体系：2.5 μL 10×PCR buffer；2 μL dNTP（各2.5 mmol·L-1）；1.5 μL 25 mmol·L-1 MgCl2；0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U·μL）；8.5 μL ddH2O； P1，P2引物（2 μmol·L-1）各3 μL；cDNA 4 μL。扩增程序：①95 ℃预变性4 min；②第1至第30个循环，94 ℃变性40 s，59 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s；③最后72 ℃延伸10 min。扩增结束后，用1.0%的1×TAE琼脂糖凝胶进行电泳紫外灯观察并照相。TMV的PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序。

3 结果与分析

3.1 IC-RT-PCR扩增 用TMV抗血清捕获抗原来获得TMV的RNA，进行IC-RT-PCR，均扩增出了约300 bp的预期目的条带，见图1。将经过脱毒处理的试管苗也进行IC-RT-PCR，得到预期目的条带的株系说明未脱除TMV，而没有扩增出片段的株系说明脱除了TMV，检测结果见图2。

3.2 PCR产物的序列分析 将TMV的IC-RT-PCR的扩增产物进行测序，获得了TMV扩增产物的核苷酸序列，测序结果获得的片段长度为276 bp，与已报道的地黄TMV CP基因（GenBank AY555269）的核苷酸序列的同源性比较，其同源性达95.29%，将其翻译为氨基酸见图4，氨基酸同源性达96.7%，仅有3个氨基酸有差异，见图5。说明扩增出的产物确为TMV的特异性片段，此方法可以用于怀地黄的TMV检测。

4 讨论

地黄病毒病是一种系统性感染疾病，可随地黄的无性繁殖过程持续传播。病毒在地黄机体中大量增殖，严重影响了地黄细胞的正常代谢活动，使其叶片的功能期显著缩短，田间常见因症状严重而早衰的叶片。其田间表现多为褪绿及黄化、花叶、黄斑、畸形、块根细小粗糙等症状。因此，地黄病毒病是造成地黄产量和质量下降的主要因素之一。张振臣等[3]、高雅红等[5]分别研究河南、河北地黄发现，侵染的主要病毒种类均为TMV，张振臣等继续完成了该病毒的基因组全序列测定，认为该病毒是Tobamovirus的一个新成员[6]。其在茄科的心叶烟、黄花烟、蔓陀罗；番杏科的番杏；藜科的苋色藜和昆诺藜上表现为局部枯斑症状。在红花烟、普通烟、番茄和白菜等植物上表现为系统花叶症状[7]。因此，建立一套快速、灵敏、高效的TMV病毒检测技术对怀地黄病毒病的防治有重要意义。

近年来，植物病毒的检测方法主要有电镜法、酶联免疫吸附法（ELISA）和RT-PCR技术等。电镜法取样较简便，检测快速且结果比较直观[8]，但是这种方法操作难度比较大，且容易受破碎的细胞器的干扰而影响判断的结果；且用电镜观察时需要样品含有的病毒浓度较高，因此要经过反复提纯，如果样品中病毒粒子的浓度较低，就很容易出现假阴性结果。ELISA检测植物病毒特异性强，灵敏度较高，一次可检测大量样品；但ELISA法容易出现假阳性反应[9]，从而使其检测的灵敏度降低。RT-PCR法灵敏度高、特异性强、重复性好，应用微量感病组织汁液即可灵敏的检测到病毒的存在。但是病毒RNA的成功提取是运用RT-PCR技术的前提，由于RNA酶的存在，在RNA提取过程中对各种试剂及各步操作均有严格的要求，因此，对于大批量样品的病毒检测，RNA提取的工作量太大。

而IC-RT-PCR检测技术是免疫学方法与RT-PCR技术相结合建立起来的检测技术。该技术不需进行病毒RNA的提取，操作更容易，且由于病毒外壳蛋白的保护作用，病毒RNA不易降解，同时也缩短了检测时间[10]，并且又可以避免ELISA法容易出现假阳性的问题。又由于IC-RT-PCR经过了双重的特异性选择，即首先通过特异性抗血清来选择病毒粒子，然后又通过特异性的引物再进行筛选，使得结果更为可靠。IC-RT-PCR唯一不足是不适合于不易制备血清的病毒的检测[11]。Kilic等用DAS-ELISA，RT-PCR，IC-RT-PCR检测土耳其湖泊地区甜菜中的甜菜坏死黄脉病毒时发现，DAS-ELISA检测为阴性的50株样品进行RT-PCR后，发现25株呈阳性，而另外25株呈阴性的样品进行nRT-PCR检测发现19株呈阳性，余下的6株阴性样品进行IC-RT-PCR后，又有2株呈阳性，说明IC-RT-PCR的灵敏度最高[12]。

本试验用TMV抗血清将TMV捕获后，加入释放物质使病毒RNA释放出来，然后通过RT-PCR反转录后进行扩增，经电泳检测带毒植株在280 bp处出现特异性条带，将PCR扩增液进行测序，测序结果进一步证明了本试验所建立的检测程序的正确性。扩增产物与地黄TMV CP基因其核苷酸序列的同源性达95.29%，其氨基酸同源性达96.7%，因此，本试验所建立的IC-RT-PCR程序完全可以用于怀地黄TMV病毒的批量检测。

[参考文献]

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[12] Kilic H C，Yardimci N.Nested RT-PCR and immunocapture RT-PCR for detection of beet necrotic yellow vein virus on sugar beet in lake district of turkey[J].Rom Agr Res，2012，29：333.

Detection of tobacco mosaic virus（TMV） in Rehmannia glutinosa f.

hueichingensis by IC-RT-PCR

DU Lin*， XIANG Jin-le， FAN Jin-ling， LI Xin， LUO Lei

（Food and Bioengineering College， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China）

[Abstract] Objective： To establish a rapid，sensitive and efficient detection method for tobacco mosaic virus （TMV）， and provide technical support of TMV detection of Rehmannia glutinosa f. hueichingensis. The virus-free plantlets could be produced on a large scale to ameliorate breed degeneration caused by viral disease. Method： Specific primers were designed based on the conserved region of coat protein（CP）gene of TMV. Immunocapture RT-PCR （IC-RT-PCR） was employed to detect TMV and the sequence of the products was detected. Result： The expected nucleotide acid fragments were amplified by IC-RT-PCR. The homology of nucleotide acid sequence and amino acid sequence were 95.29% and 96.7% between the PCR products and the CP gene of TMV（accession number AY555269）. Conclusion： The method was established for the detection of TMV in R. glutinosa f. hueichingensis by IC-RT-PCR. This detection combined molecular biology technology with immunology，was convenient for a quick， sensitive and simple detection of TMV.

[Key words] Rehmannia glutinosa f. hueichingensis； TMV； IC-RT-PCR； sequence analysis； virus detection

doi：10.4268/cjcmm20131311