利用分子印迹技术从中药粗提物中定向分离胡黄连苷Ⅱ的研究

[摘要] 胡黄连苷Ⅱ为神经保护的中药活性成分，但其传统的分离工艺较复杂，效率较低，溶剂用量大，环境不友好，而分子印迹技术是一门分子识别技术，其制备的分子印迹聚合物因具有特异性结合位点而对目标分子有较高的选择吸附性，能够克服传统分离技术的以上缺点。该研究以胡黄连苷Ⅱ为模板，采用沉淀聚合法制备了胡黄连苷Ⅱ的分子印迹聚合物，并对其性能进行了研究。结果表明合成的聚合物微球不仅表面光滑，大小均匀，而且Scatchard分析得出胡黄连苷Ⅱ分子印迹聚合物的最大表观结合位点数Qmax3.02 mg·g-1，远远高于其空白印迹聚合物。充分证明利用沉淀聚合法可以合成形貌和靶向吸附能力均较好的黄连苷Ⅱ分子印迹聚合物，可用于从中药粗提物中靶向分离胡黄连苷Ⅱ及其结构类似物，有利于减少中药提取分离过程中有机溶剂的使用，环境友好，且操作简便，为中药胡黄连苷Ⅱ的高效分离提供了新的方法。

[关键词] 胡黄连苷Ⅱ；分子印迹技术；沉淀聚合法

胡黄连苷Ⅱ（picrosideⅡ）是玄参科植物胡黄连的主要成分，具有促进神经干细胞增殖的功能。目前胡黄连苷Ⅱ的提取分离通常采用溶剂提取法、水蒸汽蒸馏法和大孔树脂吸附法等传统方法，但这些方法工艺复杂、试剂消耗大、环境不友好，因此寻找新的方法从中药粗提物中快速高效地分离出胡黄连苷Ⅱ及其结构类似物具有重要的意义。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers， MIPs） 是1种对目标分子具有特异性识别和结合能力的聚合物，诺贝尔奖获得者Pauling[1]首先提出了可利用抗原作为模板来铸造抗体的空间结合位点理论，Dickey[2]首先实现了染料在硅胶中的印迹并提出“分子印迹”的概念。本文采用沉淀聚合法合成了以胡黄连苷Ⅱ为模板分子的MIPs，研究表明其对目标分子具有较高的选择吸附性，且此方法克服了传统分离方法的缺点，为中药有效成分及其类似物的提取分离提供了更加高效的方法。

1 材料

UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）， FEI Quanta 200F扫描电子显微镜（美国FEI公司），KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器系统有限公司），HH-2型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），ZYQ-211型恒温振荡器（黑龙江东拓仪器制造有限公司），DMM-90904电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

胡黄连苷Ⅱ对照品（98%，20111220），购自江苏泽朗医药科技有限公司；丙烯酰胺（AM），均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；1-乙烯基咪唑（1-Vinyl）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）均为分析纯，购于日本东京化成工业株式会社（TCI）；偶氮二异丁腈（AIBN）化学纯，购自上海试四赫维生化有限公司；乙腈为色谱纯，甲醇、冰醋酸及其他试剂均为分析纯，均购自上海星可生化有限公司。

2 方法与结果

2.1 功能单体的选择 称取胡黄连苷Ⅱ对照品，溶于50%乙腈中，配成1.95×10-2 mmol·L-1的溶液；再取适量的功能单体 （1-Vinyl） 于量瓶中，加入乙腈溶解，配成5.85×10-2 mmol·L-1的溶液。按照胡黄连苷Ⅱ与功能单体的摩尔比为1∶1～1∶6的顺序，逐次向胡黄连苷Ⅱ标准液中加入功能单体溶液，并测定其紫外光谱的变化，见图1。

胡黄连苷Ⅱ溶于50%乙腈后，在200，220，260 nm处有吸收峰，但随着功能单体的加入，只有200，220 nm处的吸收峰有变化。随着AM的加入，200，220 nm处的吸收峰都发生了明显蓝移，加入1-Vinyl 3 nm，效果更好，符合功能单体选择标准， 故本实验选择1-Vinyl作为胡黄连苷Ⅱ的功能单体。

2.2 MIPs的制备 胡黄连苷Ⅱ、功能单体1-Vinyl、交联剂EDMA以1∶5∶12的摩尔比例加入盛有150 mL 90%甲醇的圆底烧瓶中，超声溶解；加入引发剂AIBN 10 mg，溶解后，通氮气15 min，密封，60 ℃水浴聚合24 h；反应合成的聚合物经干燥后，用甲醇-冰醋酸 （9∶1） 以索氏提取的方式进行洗脱，洗去模板分子以及未聚合的功能单体和交联剂，直至紫外检测无以上物质的紫外吸收；再用甲醇洗去残留的冰醋酸，即得到胡黄连苷Ⅱ的分子印迹聚合物，经60 ℃真空干燥，备用。空白印迹聚合物（NIPs）的合成除了不加模板分子胡黄连苷Ⅱ外，其余步骤同于MIPs的制备[3-4]。

2.3 形貌表征 取适量胡黄连苷ⅡMIPs于扫描电子显微镜下观测拍照，外形和大小符合标准，见图2。从图中可以看出采用沉淀聚合法合成的胡黄连苷Ⅱ MIPs均呈现较为光滑的球状，大部分微球大小较为均匀，且分散性较好，只有小部分产生粘连。所以，利用沉淀聚合法能够合成形貌较好的胡黄连苷ⅡMIPs微球。

2.4 静态吸附实验 将上述实验合成的胡黄连苷Ⅱ MIPs与NIPs精密称取30.0 mg各6份，分别置于10 mL量瓶中，分别依次加入不同质量浓度（10～60 mg·L-1） 的胡黄连苷Ⅱ-乙腈水溶液3 mL，密闭，于恒温震荡器上震荡吸附12 h，静置，吸取上清液，用紫外分光光度计检测溶液中模板分子胡黄连苷Ⅱ的浓度变化。根据吸附前后溶液中模板分子胡黄连苷Ⅱ的浓度变化计算分子印迹聚合物的 曲线由MIPs （或NIPs）的吸附量对胡黄连苷Ⅱ-乙腈-水溶液的平衡浓度作图而得。MIPs （或NIPs）对模板分子的静态平衡吸附量（Q） 可以用以下公式计算。

式中Q为静态平衡吸附量（mg·g-1）；C0为底物的起始浓度（mg·L-1）；Cs为吸附平衡时底物的浓度（mg·L-1）；V为底物溶液的体积（L）；m为MIPs的使用量（g）。

胡黄连苷Ⅱ MIPs的吸附能力明显高于其相应的NIPs，说明分子印迹聚合物对目标分子具有选择性的吸附能力，而空白印迹聚合物由于不存在这种特异性的结合位点，对目标分子是非特异性的结合，因而吸附能力较差。

为了更加直观精确的评价MIPs的吸附性能，将MIPs与目标分子的结合量采用Scatchard方程进行分析，所用方程如下。

Qmax为聚合物对目标分子吸附的最大表观结合位点数（mg·g-1）；C为目标分子的平衡浓度（mg·L-1）；Kd为聚合物-目标分子复合物的解离常数（mg·L-1）。根据实验数据，可以计算出MIPs和NIPs的Scatchard方程，如下。

MIPs的Scatchard曲线呈较好的线性，说明在MIPs内形成了一个特异性结合位点；而NIPs的Scatchard曲线线性很差，说明NIPs的内部并没有形成对目标分子有特异性结合的位点。

根据Scatchard曲线的斜率（-1/Kd）和截距（Qmax/Kd），可以计算出胡黄连苷Ⅱ MIPs：Kd=0.024 mg·L-1，Qmax=3.02 mg·g-1；NIPs：Kd=0.013 mg·L-1，Qmax=0.37 mg·g-1。因此可以看出胡黄连苷Ⅱ MIPs对目标分子的吸附性能明显高于NIPs。

3 讨论

分子印迹技术是化学和环境科学领域的新技术，近年来已经成熟并广泛应用。将其应用于中药粗提物中活性成分的分离可以提高分离效率，减少溶剂使用量，保护环境，减少溶剂残留等，有重要意义。中医药研究领域已经有一些研究取得了可喜的进展[6-9]。本文首先采用紫外光谱法对功能单体进行筛选，确定了与模板分子胡黄连苷Ⅱ作用力最强的1-Vinyl作为功能单体；然后用沉淀聚合法制备胡黄连苷ⅡMIPs，得到的MIPs微球，不仅表面光滑、大小均匀，而且与NIPs相比对目标分子具有较高的靶向吸附性。表明采用分子印迹技术可以制备出形貌与性能都较好的胡黄连苷Ⅱ分子印迹聚合物，为胡黄连苷Ⅱ及其结构类似物的提取分离提供了新的方法，也为中药有效成分的高效分离提供了新的思路。

[参考文献]

[1] Pauling L. A theory of the structure and process of formation of antibodies [J]. J Am Chem Soc， 1940， 62（10）： 2643.

[2] Dickey F H. The preparation of specific absorbents [J]. Proc Nat Acad Sci USA， 1949， 35（5）： 277.

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[6] Yin X， Luo Y， Fu J， et al. Determination of hyperoside and isoquercitrin in rat plasma by membrane protected micro-solid-phase-extraction with high performance liquid chromatography[J]. J Sep Sci， 2012， 35：384.

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Study on directional separation of picroside Ⅱ from extract of traditional

Chinese medicine by molecularly imprinted technology

YI Li-na1， 2， LI Ke-Qin1， WANG Qiu-juan2， LIU Qing-shan1*， GUO Qing-long2

（1. China Research Center for Traditional Minority Medicine， Minzu University of China， Beijing 100081， China；

2. Pharmacology Department of China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

[Abstract] Picroside Ⅱ， separated from Chinese herbal medicine， is an active compound with neroprotective activity. Molecularly imprinted polymers （MIPs） have high affinity toward template molecules synthesized by molecularly imprinted technology for its specific combined sites， which can overcome the shortcomings of traditional separation methods， such as complex operation and low efficiency. In this paper， MIPs were prepared by precipitation polymerization with picroside Ⅱ as the template molecule， 1-vinylimidazole （1-Vinyl） as functional monomer， ethylene glycol dimethacrylate （EDMA） as cross-linker. The morphology of MIPs was characterized by scanning electronmicroscope （SEM） and its static adsorption capacity was measured by the scatchard equation. The results showed that picroside Ⅱ MIPs have spherical shape， and most of them are uniform in size. Furthermore， the maximum binding capacity （Qmax） of MIPs is 3.02 mg·g-1， higher than that of non-imprinted polymers （NIPs）. This result indicated that picroside Ⅱ MIPs with good morphology and high targeted affinity toward the template molecules can be prepared by precipitation polymerization， which can be used to separate picroside Ⅱ and its analogies from extract of Chinese herbal medicine. In addition， this method has the advantages of good environment and simple operation， which might offer a novel method for the efficient separation of picroside Ⅱin the traditional herbal medicines.

[Key words] picroside Ⅱ； molecularly imprinted technology； precipitation polymerization

doi：10.4268/cjcmm20131320