基于“有故无殒”思想的熟大黄对肝脏量―毒/效关系研究

[摘要] 目的：研究熟大黄对大鼠肝脏的量-效/毒关系，探讨熟大黄保肝与损肝的“双向”作用及炮制减毒的客观真实性。方法：同时采用正常和病理动物，在较大剂量范围（生药2.0，5.4，14.7，40.0 g・kg-1・d-1）考察熟大黄总提物对实验动物一般状态、生化指标和组织病理的影响，并通过因子分析方法综合分析熟大黄量-效/毒关系。结果：采用因子分析法从给药后显著变化的9个生化指标中抽提出2个公因子，公因子1主要由HA，LN和TGF-β1主导，可解释为纤维化因子；公因子2主要由ALT，AST和ALP主导，可解释为细胞损伤因子。因子分析结果表明熟大黄对大鼠肝脏存在明显的药效与毒性“双向”作用：对CCl4诱导的慢性肝损伤具有显著的保护作用，而对正常动物具有一定的肝毒性作用。病理检查结果与因子分析结果一致。可比剂量下，熟大黄的保肝作用强于生大黄，而毒性较低。结论：熟大黄对正常动物具有一定的肝毒性作用，但用于肝损伤动物具有显著的治疗作用，在一定程度上印证了“有故无殒”之说和辨证用药减毒的科学性。“有故无殒”思想对正确认识与研究中药量-效/毒关系、指导辨证用药具有重要价值。

[关键词] 熟大黄；量-效/毒关系；保肝；肝损伤；因子分析；炮制减毒增效

[收稿日期] 2014-01-02

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81373984，81173571）；中央本级课题（20603020101）

[通信作者] 王伽伯，助理研究员，Tel/Fax：（010）66933325，E-mail：；肖小河，研究员，主要从事中药临床药学研究，Tel：（010）66933322，E-mail：

[作者介绍] 王艳辉，硕士研究生，Tel/Fax：（010）66933325，E-mail：

大黄是我国特产著名传统中药，因作用峻烈被称为“将军”，现临床常用于胃肠道疾病以及慢性肝病、肾病的长期治疗[1-2]。但近年来报道长期应用大黄可致肝、肾损害[3-4]，引起国内外研究者对大黄安全性的疑虑。大黄可用于慢性肝病患者的保肝治疗，同时又可导致正常动物肝损伤，如何理解这种保护与损伤“双向”作用？事实上，任何药物都可能有毒副作用，关键在于使用是否得当。如《黄帝内经》中有“有故无殒”之说，原文指孕妇用药只要针对病因可以使用峻烈之药，取药之疗效而不致损害[5]。张锡纯在《医学衷中参西录》中记载“大黄之力虽猛，然有病则病当之，恒有多用不妨者”。笔者课题组前期研究表明，生大黄大剂量长期使用可引起大鼠肝、肾损伤，但用于肝炎和肾衰竭大鼠反而可以起到良好的治疗作用[6]。因此，大黄肝毒性评价问题的关键，不只是在正常动物上评价其绝对毒性大小，更重要是在疾病模型动物上模拟临床实际情况研究其合理用药减（避）毒的途径和机制。为此，本文借鉴“有故无殒”思想，以临床治疗肝病常用的熟大黄为研究对象，通过对比熟大黄在正常和疾病动物模型上的效/毒作用差异，阐明熟大黄对肝脏的量-效/毒关系，为科学评价大黄对肝脏的毒副作用和指导临床合理用药提供依据。

1 材料

1.1 动物 SD种大鼠，180只，雌雄各半，SPF级，6～8周龄，体重（180±30） g，购于中国人民军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK-（军）2007-004。雌雄分笼饲养于302医院实验动物中心[SYXK（军）2002-00500]。自由进食及饮水，实验室温度（22±2） ℃，湿度60%～80%，人工光照约12 h明暗周期，并定期消毒。

1.2 药物 大黄购于甘肃省陇南地区礼县，经肖小河研究员鉴定为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎，由北京仟草中药饮片有限公司按药典方法炮制为熟大黄。熟大黄总提取物制备：取一定量熟大黄加6倍量90%乙醇，加热提取3次，每次1 h。取醇提残渣，加10倍量水，加热提取1 h。合并滤液，喷雾干燥制成粉末保存备用。

1.3 试剂与仪器 CCl4（20060525，北京北化精细化学品有限责任公司）；橄榄油（F20080219，国药集团化学试剂有限公司）；TGF-β1试剂盒（090120，北京普尔伟业科技有限公司）；Sn-69513型免疫计数器（上海核所日环光电仪器有限公司）；生化免疫指标由302医院检验科协助检测，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 以临床常用偏高剂量、前期研究上限剂量为最低、最高剂量，等比设定4个剂量组（生药2.0，5.4，14.7，40.0 g・kg-1）。将动物预养1周后，随机分为10组，每组18只，雌雄各半：空白组（N）、模型组（M）、空白组+熟大黄剂量Ⅰ组（NPD1）、空白组+熟大黄剂量Ⅱ组（NPD2）、空白组+熟大黄剂量Ⅲ组（NPD3）、空白组+熟大黄剂量Ⅳ组（NPD4）；模型组+熟大黄剂量Ⅰ组（MPD1）、模型组+熟大黄剂量Ⅱ组（MPD2）、模型组+熟大黄剂量Ⅲ组（MPD3）、模型组+熟大黄剂量Ⅳ组（MPD4）。将CCl4与橄榄油配成10%的油剂CCl4（1∶10），对大鼠腹部注射给药，每周2次，5 mL・kg-1，称重1次/周，按实际体重调整剂量，持续12周。以上各给药组均自模型复制4周末开始灌胃给药至16周末，每天1次，每周6 d，20 mL・kg-1，空白组与模型组给予等体积生理盐水，称重每周1次，按实际体重调整剂量。

2.2 生化指标测定 在给药第16周末，每组随机抽取10只大鼠，雌雄各半，股动脉取血，离心后按说明书要求测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AP）、总胆红素（TBIL）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、总胆固醇（CHOL）、透明质酸（ HA）、层粘蛋白（ LN）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、转化生长因子（TGF-β1）。

2.3 组织病理检测 实验结束后处死动物，剖腹取肝脏，冰生理盐水清洗血迹，滤纸吸尽表面水分，精确称重，切取左叶肝脏固定于10%福尔马林液中常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、光镜下观察。

2.4 统计学方法 所有实验数据以±s表示，各组之间比较采用单因素方差分析以及多元统计分析（因子分析），均采用SPSS 13.0统计软件处理，显著性概率水平α=0.05。

3 结果

3.1 动物一般状况变化 各正常动物组给予熟大黄总提物后，出现排稀便，软便，体重增长抑制，被毛脏乱、红染，精神不振，尿液呈深红色等现象，尤以高剂量组明显。恢复期各组动物基本情况良好。给药期间，虽然各正常动物组体重总体皆呈现增长趋势，但是从给药第5周开始，高剂量组动物体重增长趋势弱于低剂量组，呈现出体重增长的显著抑制作用，而后体重一直处于较缓慢的增长状态。恢复期动物体重增长情况良好。

造模组动物以CCl4橄榄油造模数天后，模型动物均表现出毛泽灰暗，饮食量减少，萎靡少动，抓持力弱，体重增长缓慢甚至下降等现象。实验过程中，造模动物体重整体水平呈增长趋势。与空白组比较，造模及造模给药组体重增长缓慢；与模型组比较，低剂量组体重增长较快，而高剂量组在给药后期对体重增长的抑制作用明显。恢复期各组动物体重增长情况良好。模型动物各剂量组给药后可见动物排稀便、软便，体重增长缓慢甚至下降，皮毛脏乱，精神不振等，尿液呈橙色，并且部分动物出现死亡现象，尤以高剂量明显。恢复初期模型组动物毛色泽灰暗，高剂量组动物被毛红染，大便逐渐转为正常，其他未见明显异常。

3.2 对大鼠血清指标的影响 不同实验组大鼠部分显著性变化的生化指标见表1。各正常动物组在实验第16周末，与N组比较，NPD4组AST，NPD3，NPD4组ALT，NPD4组TBIL，NPD4组HA，NPD3，NPD4组TGF-β1具有明显差异。各模型动物组在实验第16周末，与N组比较，M组AST，ALT，TBIL，HA，LN，TGF-β1，ALP均显著增高；与M组比较，MPD1～4组AST，ALT，MPD1，MPD2组TBIL，HA，LN，TGF-β1，MPD1～3组ALP均显著降低；而MPD4组HA，LN，TGF-β1呈现增高趋势。

3.3 肝组织病理改变 各正常动物组在实验第16周末，与N组比较，熟大黄组随剂量增大动物的肝细胞空泡变性，由散在的轻微小空泡样变性转化为弥漫性的轻中度中小空泡变性，并且NPD4组在汇管区及肝胞膜部位出现轻微的纤维组织增生；各模型动物组在实验第16周末，与N组比较，M组肝细胞胞浆重度空泡变性；偶见轻微点状或小灶状的肝细胞坏死；汇管区和间质见小灶状淋巴细胞浸润；部分包膜增厚、汇管区和间质见纤维增生。与M组比较，MPD1组动物肝细胞空泡变性与模型组比较明显减轻；MPD2组动物肝细胞空泡变性和纤维增生都明显减轻；MPD3组动物肝细胞空泡变性和纤维增生等病变程度减轻的更明显；MPD4组动物肝细胞空泡变性有所减轻，偶见轻微的肝细胞坏死，汇管区和间质都可见轻微或轻度的小灶状淋巴细胞浸润，包膜、汇管区和间质见纤维增生转为轻、中度，见图1。

3.4 基于因子分析的熟大黄量-效/毒关系研究 为了直观显示出熟大黄的量-效/毒关系变化规律，采用因子分析法提取给药熟大黄后变化明显的9个生化指标的公因子。为了比较炮制减毒，本文将前期发表的生大黄对正常与慢性肝损伤模型动物的数据[8]也纳入因子分析，见表2。因子分析模型的KMO统计量=0.793>0.50；Bartlett′s Test χ2+=160.167，单侧P

根据因子载荷图可以很直观地看出熟大黄的量-效/毒关系的演变趋势，见图2，图中标记点为各组数据的均值。模型组（M）在横轴（纤维化）方向与纵轴（细胞损伤）方向上都远离正常组（N），说明CCl4成功诱导了大鼠肝细胞损伤及纤维化。正常动物给予熟大黄组（NPD1～4）相对于空白组（N），随剂量增加，沿着横轴（纤维化）方向与纵轴（细胞损伤）方向逐渐偏离，以纤维化方向明显，说明熟大黄随剂量增加可损伤大鼠肝功能；而模型大鼠给予熟大黄（MPD1～4），相对于模型组（M），在纵轴（细胞损伤）方向4个剂量都不同程度地促进了肝细胞修复，呈剂量依赖性；但是在横轴（纤维化）方向，随剂量增加熟大黄抗纤维化作用反而逐渐减弱，其中低剂量（MPD1，MPD2）抗纤维化作用明显，高剂量（MPD3）抗纤维化作用差，尤其超高剂量（MPD4）还加重了肝纤维化，表明熟大黄治疗CCl4诱导慢性肝损伤具有药效与毒性的“双向”作用。与熟大黄相比，生大黄各给药组在横轴和纵轴的变化更显著：在正常动物，生大黄各剂量组表现出的肝损伤作用均强于熟大黄；在模型动物，生大黄的治疗效果弱于熟大黄。

4 讨论

大黄并非传统的毒剧药物，通常认为其毒性较小，但当长期使用大黄治疗慢性疾病时，其潜在的肝肾毒性不容忽视。本文在较大剂量范围（生药2.0，5.4，14.7，40.0 g・kg-1・d-1）考察了熟大黄药效与毒性的关系。从大鼠给药后一般状况、血液生化指标和病理改变结果可以看出，在正常生理状态下与病理状态下的大鼠，给予熟大黄提取物所表现出来的药效与毒性结果差异明显：在正常大鼠给予熟大黄提取物，随着剂量增加大鼠体重增长抑制，与肝细胞损伤有关的血清ALT，AST以及与等指标呈剂量依赖的增高趋势，肝脏病理切片显示最高剂量组（NPD4）大鼠出现纤维化改变；而熟大黄作用于模型组大鼠，在较低的2个剂量表现出显著降低模型动物ALT，AST，HA和TGF-β1的保护作用，病理损伤也显著改善。结合因子载荷图表征的熟大黄量-效/毒关系（图2），可以看出熟大黄在高剂量（40 g・kg-1）时对正常动物可造成肝损伤，低、中剂量（2，5.4 g・kg-1）对肝损伤模型大鼠具有显著的治疗作用，但高剂量（40 g・kg-1）时反而加重了模型大鼠肝损伤。这一结果提示在使用对症、剂量恰当的情况下，熟大黄可以安全地用于慢性肝病的治疗，在一定程度上印证了“有故无殒”之说。

“有故无殒”思想指出药物毒与不毒，不仅在于其自身，更在于其是否对证（病）使用，通俗地说即是“有病则病当之，无病则体受之”，是中药传统毒性理论的重要内容，也是最能反映中医辨证用药思想的理论认识之一。“有故无殒”是一个非常有趣的现象，一般认为，正常状态机体对外界药物毒性刺激的耐受力较高，而病理状态机体的耐受力应该较低，但“有故无殒”描述的现象却恰好与一般认知相反。很多研究证实中药“有故无殒”的现象是客观存在的，如附子对正常大鼠的心脏毒性强于肾阳虚模型和脾阳虚模型大鼠[11-12]，内在机制上表现为附子对生理和病理状态大鼠心肌酶的影响不同[13]；雷公藤多苷对正常大鼠的肝功能血生化指标的影响也大于关节炎模型大鼠[14]。本文结果也证实大黄的量-效/毒关系具有类似规律。

从现代医学的视角来看，“有故无殒”包含2层意思：①中药的治疗作用和毒副作用，在不同机体状态下的表现可能不同；②中药的毒副作用与用药剂量和周期有关。第一层含义是中药毒、效和“证”相关性的问题；第二层含义是中药量-时-效-毒关系的问题。由此可见，“有故无殒”的思想对正确认识与研究中药量-效/毒关系、指导临床辨证用药具有重要的理论和应用价值，为中药的量-效/毒关系研究提出了一个独特研究模式，即在正常生理状态和不同病理状态机体的药理和毒理比较研究，笔者认为可称之为病理毒理学（pathotoxicology）。简单地说，就是在病理模型动物上评价药物毒性，并与正常动物个体平行对比，从而更准确地反映其应用于临床患者时的实际情况，并合理制定其可能的“治疗窗”范围，为临床合理用药提供科学依据。

“有故无殒”的生物学机制尚不明确。从现代医学研究也可以看到类似“有故无殒”现象。如近期一项研究表明，处于肝纤维化病理状态下的小鼠对致死量的肝毒性物质如D-半乳糖苷、脂多糖、四氯化碳或对乙酰氨基酚均表现为很强的耐受性，未发生死亡且仅表现为轻度的肝损害；而正常组小鼠则大部分因急性肝衰竭死亡。机制研究表明，在肝纤维化时肝脏的细胞微环境（microenvironment）处于免疫抑制状态，表现为调节T细胞和2型枯否细胞大量产生，同时肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1（IL-1）、高迁移金属蛋白1（HMGB1）被显著抑制，因而机体对外部毒性刺激不敏感或不应答[15-16]。细胞微环境的改变，对器官和机体功能的调控影响极其重要。大黄的有故无殒现象是否也和上述肝脏细胞微环境有关，值得深入研究阐明。

本文所用熟大黄与前期发表的生大黄研究为同一批次药材炮制而得，并在同一实验平行完成，因此结果具有可比性。通过因子分析对比，表明在相同剂量下，熟大黄的肝脏保护作用显著优于生大黄，而且毒性损伤作用显著低于生大黄，提示大黄炮制后可减毒增效，也证实临床用熟大黄治疗肝病而非生品的合理性。结合前期实验分析，大黄炮制“减毒”的机制可能体现在鞣质含量下降使肝损害作用减弱；而炮制“增效”的机制可能体现在结合蒽醌转化为游离态蒽醌，生物利用度提高，药效作用增强[17]。

中医自古有使用毒峻中药的传统，毒峻中药往往起效快、疗效显著，但易出现毒副作用。为此，传统中医学形成和发展了多种减毒理论和方法，如炮制减毒、配伍减毒和辨证用药减毒等。其中炮制、配伍减毒较为熟知，并提炼为相应的炮制减毒理论和配伍减毒理论，然而辨证用药减毒强调不多、研究较少。发展和研究“有故无殒”和辨证用药减毒理论[18]，对于完善中医药减毒理论和方法具有重要价值。

[参考文献]

[1] Sheng X Y， Wang M， Lu M， et al. Rhein ameliorates fatty liver disease through negative energy balance， hepatic lipogenic regulation， and immunomodulation in diet-induced obese mice[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，300：E886.

[2] Zhao Y L， Wang J B， Zhou G D， et al. Investigations of free anthraquinones from rhubarb against α-naphthylisothiocyanate-induced cholestatic liver injury in rats[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol， 2009，104：463.

[3] Nasr S H， D′Agati V D， Said S M， et al. Oxalate nephropathy complicating Roux-en-Y gastric bypass： an underrecognized cause of irreversible renal failure[J]. Clin J Am Soc Nephrol， 2008，3：1676.

[4] Yan M， Zhang L-Y， Sun L-X， et al. Nephrotoxicity study of total rhubarb anthraquinones on Sprague Dawley rats using DNA microarrays[J]. J Ethnopharmacol，2006，107：308.

[5] 金磊， 刘喜明.论《 黄帝内经》“有故无殒， 亦无殒” 的含义及临床意义[J].陕西中医， 2013，34（2）：206.

[6] Xiang Y Z， Shang H C， Gao X M， et al. A comparison of the ancient use of ginseng in traditional Chinese medicine with modern pharmacological experiments and clinical trials[J]. Phytother Res，2008，22（7）：851.

[7] Wang J-b， Zhao H-p， Zhao Y-l， et al. Hepatotoxicity or hepatoprotection pattern recognition for the paradoxical effect of the Chinese herb Rheum palmatum L. in treating rat liver injury[J]. PLoS ONE，2011，6（9）：e24498.

[8] Napoli J， Prentice D， Niinami C， et al. Sequential increases in the intrahepatic expression of epidermal growth factor， basic fibroblast growth factor， and transforming growth factor beta in a bile duct ligated rat model of cirrhosis[J]. Hepatology， 1997，26（3）：624.

[9] Miele L， Forgione A， La Torre G， et al. Serum levels of hyaluronic acid and tissue metalloproteinase inhibitor-1 combined with age predict the presence of nonalcoholic steatohepatitis in a pilot cohort of subjects with nonalcoholic fatty liver disease[J]. Transl Res，2009，154（4）：194.

[10] Bourbonnais E， Raymond V A， éthier C， et al. Liver fibrosis protects mice from acute hepatocellular injury[J]. Gastroenterology，2012，142：130.

[11] 陈学习. 附子对病证动物模型基础毒性作用的实验研究[D]. 成都：成都中医药大学， 2006.

[12] 王秀娟，谭勇，赵宏艳，等. 基于证候理论观察白附片对正常和肾阳虚证大鼠心肌酶的影响[J]. 中国实验方剂学杂志， 2009（11）：52.

[13] 谭勇，吕诚，赵宏艳，等.白附片对正常和肾阳虚大鼠血液生化指标的影响[J]. 中国中医药信息杂志， 2010（1）：31.

[14] 吕永恒，吕诚，谭勇，等.雷公藤多苷对佐剂性关节炎大鼠血液生化学指标的影响[J].中国中医基础医学杂志， 2009（3）：213.

[15] Qin L， Han Y P. Epigenetic repression of matrix metalloproteinases in myofibroblastic hepatic stellate cells through histone deacetylases 4：implication in tissue fibrosis[J]. Am J Pathol，2010，177（4）：1915.

[16] Singhubera J， Zhua M， Prinza S， et al. Aconitum in traditional Chinese medicine―a valuable drug or an unpredictable risk[J]. J Ethnopharmacol， 2009，126：18.

[17] 王伽伯，马永刚，张萍，等.炮制对大黄化学成分和肝肾毒性的影响及其典型相关分析[J].药学学报， 2009，44（8）：885.

[18] 周宜，陈钢，夏丽娜，等.从《内经》“有故无殒”思想看中药毒性研究[J].中国中医基础医学杂志，2007，13（5）：342.

Study on dosage-toxicity/efficacy relationship of prepared rhubarb on

basis of symptom-based prescription theory

WANG Yan-hui， ZHAO Hai-ping， WANG Jia-bo， ZHAO Yan-ling， XIAO Xiao-he

（1. China Military Institute of Chinese Materia Medica， 302 Military Hospital， Beijing 100039， China；

2.School of Medicine， Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

3. School of Medicine， Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China；

4.Integrative Chinese and Western Medical Center for Liver Diseases， 302 Military Hospital， Beijing 100039， China）

[Abstract] Objective： To investigate the dosage-efficacy/toxicity relationship of prepared rhubarb， in order to explore the bidirectional effects in hepatoprotection and hepatotoxicity of prepared rhubarb and the objective authenticity for attenuating toxicity by processing. Method： Normal and pathological animals were adopted simultaneous to investigate the effect of total extracts from prepared rhubarb within a high dose range （2.0， 5.4， 14.7， 40.0 g・kg-1・d-1） on normal state， biochemical index and histopathology of experimental animals. The factor analytic approach was used to analyze the dosage-efficacy/toxicity relationship of prepared rhubarb. Result： The factor analytic approach was used to extract two common factors from the nine biochemical indexes. The firs common factor was mainly dominated by HA， LN and TGF-β1， and could be explained as fibrotic factors. The second common factor was mainly dominated by ALT， AST and ALP， and could be explained as cellular factor. The results of the factor analysis suggested that prepared rhubarb showed significant bidirectional effects in hepatoprotection and hepatotoxicity， which could protect liver in CCl4 injured chronic hepatic injury， but had a certain hepatotoxic effect to normal animals. The pathological examination showed consistent results with the factor analysis. Under comparable dosages， prepared rhubarb showed a stronger liver protecting effect than crude rhubarb， with a lower toxicity. Conclusion： Although prepared rhubarb has a certain hepatotoxic effect to normal animals， it has also a significant therapeutic effect to animals with liver injury. The results proved the symptom-based prescription theory and the scientificity of the symptom-based medication. The symptom-based prescription theory is important to correctly realize the dosage-efficacy/toxicity relationship of traditional Chinese medicines and guide the symptom-based medication.

[Key words] prepared rhubarb； dosage-efficacy/toxicity relationship； liver protection； hepatotoxicity； factor analysis； toxicity-attenuating and efficacy-enhancing by processing

doi：10.4268/cjcmm20141524