梓醇抑制NADPH氧化酶保护2型糖尿病早期血管内皮功能

[摘要] 该研究观察梓醇对2型糖尿病（T2DM）大鼠血管内皮功能的保护作用并探讨其抑制NADPH氧化酶表达的机制。40只高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素致糖尿病大鼠随机分为模型组、梓醇低、中、高剂量组（10，50，100 mg・kg-1・d-1）。另以10只健康Wistar大鼠作为正常组。正常组、模型组分别给予相当量的生理盐水。6周后全自动生化分析仪检测血糖、血脂；ELISA检测血清8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）含量；硝酸还原法检测血清一氧化氮（NO）水平；羟胺法检测血清超氧化物歧化酶（SOD）含量；观察离体胸主动脉环内皮依赖性血管舒张反应；荧光法检测主动脉组织活性氧（ROS）的水平；HE染色观察主动脉病理形态学改变；RT-PCR，western-blot分别检测主动脉组织Nox4，p22phox mRNA及蛋白表达。结果显示梓醇中、高剂量组血管内皮损伤明显减轻，主动脉ROS水平降低，血清NO水平升高，8-iso-PGF2α含量减少，SOD含量升高；主动脉组织Nox4，p22phox mRNA及蛋白表达均降低，差异均有统计学意义（P

[关键词] 2型糖尿病；内皮功能；氧化应激；NADPH 氧化酶

[收稿日期] 2014-04-03

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81300688）；山东省自然科学基金项目（ZR2009CQ013）；山东省中医药管理局项目（2013-237）

[通信作者] 刘江月，讲师，研究方向为糖尿病血管并发症的防治，E-mail：

近年来我国T2DM患病率呈明显上升趋势，糖尿病对人类健康的主要危害不是糖尿病本身，而是各种慢性并发症。动脉粥样硬化（AS）是糖尿病致死致残的主要并发症之一，血管内皮细胞损伤和功能障碍是AS形成的始动环节。氧化应激是糖尿病血管内皮功能障碍的重要原因之一[1]。梓醇是从地黄中提取的环烯醚萜类化合物，是地黄的有效活性成分之一[2]。研究表明梓醇具有降血糖、抗肿瘤、保护神经等[3-5]多种药理作用。近年来多项研究发现[6-8]，梓醇能够通过清除自由基调控凋亡相关蛋白发挥保护心血管系统的功能。目前，关于梓醇是否能够保护糖尿病早期血管内皮功能国内外尚未见报道。本研究通过高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，从氧化应激角度，以NADPH氧化酶为靶点，探讨梓醇对糖尿病早期血管内皮功能的保护作用及其可能机制。

1 材料

1.1 动物 雄性Wistar大鼠，SPF级，体重（216.8 ±15.3） g，购自青岛市实验动物和动物实验中心，许可证号SCXK（鲁）20130010。

1.2 饲料 ①标准饲料：青岛市实验动物和动物实验中心提供普通大鼠饲料。②高糖高脂饲料：普通大鼠饲料83.25%，1.5%胆固醇、0.25%胆酸钠、10%猪油、5%蔗糖，由潍坊医学院实验动物中心配制。

1.3 药品与仪器 梓醇对照品购自南京森贝伽生物科技有限公司，链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）购自上海前尘生物科技有限公司；大鼠 NO，8-iso-PGF2α，SOD检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，活体组织氧化应激活性氧（ ROS）初级荧光测定试剂盒（genmed），Nox4，p22phox多隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，Nox4，p22phox引物购自上海生工生物工程有限公司，转膜仪（美国Biorad公司），凝胶成像分析仪（美国Biorad公司），BL-420E生物机能实验系统、JH-2型张力换能器均购自成都泰盟科技有限公司。

2 方法

2.1 糖尿病模型造模方法及分组 60只雄性Wistar大鼠适应性饲养1周后，高糖高脂饮食1月后腹腔注射STZ（30 mg・kg-1），72 h后空腹血糖大于11.1 mmol・L-1为糖尿病建模成功。随机抽取糖尿病大鼠40只，分为模型组、梓醇低、中、高剂量组，每组10只，继续高糖高脂喂养，同时梓醇低、中、高剂量组分别给予梓醇10，50，100 mg・kg-1・d-1灌胃。10只健康Wistar大鼠作为正常组，标准饲料喂养，正常组和模型组给予相当量的生理盐水灌胃，喂养6周。观察各组大鼠一般状况，摄食量及体重变化。

2.2 血糖、血脂及血清8-iso-PGF2α，SOD，NO的检测 各组大鼠于最后一次灌胃后，禁食12 h，不禁水。10%水合氯醛300 mL・kg-1腹腔注射，麻醉后固定，下腔静脉取血后分离血清 （3 000 r・min-1，10 min），全自动生化分析仪检测血糖、血脂；硝酸盐还原酶法测定血清NO含量，ELISA试剂盒检测血清8-iso-PGF2α含量，羟胺法检测SOD活性。

2.3 主动脉内皮功能检测 大鼠处死后立刻取出主动脉，置于Krebs液中，剥离周围组织后剪成主动脉环，一端固定于水浴槽中，另一端连接张力换能器，通过BL-420e生物机能实验系统观察记录血管张力变化，苯肾上腺素（PE）（1×10-6 mol・L-1）预收缩血管稳定后， 累积浓度法加入乙酰胆碱（Ach）观察内皮依赖性血管舒张反应[9]，绘制浓度-舒张曲线，平衡后累积浓度法加入PE观察血管收缩反应[10] ，绘制浓度-收缩曲线。舒张反应以占PE（1×10-6 mol・L-1）收缩值的百分比表示，收缩反应以KCl（3×10-2 mol・L-1）引起收缩反应的百分比表示。

2.4 主动脉ROS测定 取小段胸主动脉，研磨组织后，按照genmed活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒操作说明书检测主动脉ROS含量。

2.5 主动脉HE染色 取小段胸主动脉，10%福尔马林固定，石蜡包埋后5 mm切片，HE染色，光镜下观察。

2.6 RT-PCR法检测主动脉Nox4，p22phox mRNA表达 取主动脉组织，Trizol提取总RNA，按逆转录试剂盒操作步骤进行RT反应，所得cDNA 在PCR 仪上进行扩增。2 μL 的cDNA 为模板，β-actin 为内参，PCR 反应参数：预变性95 ℃ 2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，共32个循环，72 ℃延伸7 min。Nox4上游引物5′-TAGCTGCCCACTTGGTGAACG-3′，下游引物5′-TGTAACCATGAGGAACAATACCACC-3′，扩增长度为245 bp； p22phox上游引物5′-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3′，下游引物5′-TCACACGACCTCATCTGTCAC-3′，扩增长度为455 bp。

2.7 Western-blot法检测主动脉Nox4，p22phox蛋白表达 取主动脉组织，提取总蛋白，SDS-PAGE电泳，转膜后加一抗（1∶500）4 ℃过夜，TBST漂洗3次，加入二抗孵育1 h，ECL显影，暗室曝光，图像分析。

2.8 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间采用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，P

3 结果

3.1 各组大鼠一般状况 实验过程中，模型组大鼠死亡2只，梓醇低剂量组死亡1只，正常组和梓醇中、高剂量组均无死亡。随着实验进程正常组和梓醇高剂量组大鼠一般状况好，毛发油亮，反应敏捷，摄水摄食正常，体重稳步增长；而模型组和梓醇低剂量组大鼠却每况愈下，毛色暗淡，反应迟钝，甚至部分动物尾部皮肤出现溃烂，摄水摄食量较正常组明显增多，但体重却增长缓慢，梓醇中剂量组大鼠一般状况较正常组和梓醇高剂量组大鼠差，但与模型组相比，上述症状明显改善。

3.2 血糖、血脂及血清8-iso-PGF2α，SOD，NO 各组大鼠血糖、血脂比较见表1。6周后模型组及梓醇低剂量组大鼠血糖、血脂水平较正常组均明显升高，与模型组比较梓醇高剂量组血糖、血脂均显著降低（P

3.3 主动脉内皮功能检测 各组大鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张反应见图1。模型组、梓醇低剂量组大鼠胸主动脉对ACh的舒张反应均显著低于正常组（P

3.4 主动脉ROS测定 各组大鼠主动脉ROS含量见图3。模型组、梓醇低剂量组大鼠主动脉ROS含量较对照组大鼠明显降低（P

3.5 主动脉HE染色 各组大鼠主动脉壁病理形态改变见图4。HE染色后光镜下观察，正常组大鼠主动脉内膜光滑，内皮细胞完整，平滑肌层排列整齐，模型组、梓醇低剂量组，主动脉内膜连续性破坏明显破坏，内皮细胞体积增大。梓醇中、高剂量组主动脉壁各层细胞排列规则，病变明显减轻。

3.6 RT-PCR法检测主动脉Nox4，p22phox mRNA表达 主动脉Nox4，p22phox mRNA表达见图5。与正常组比较， 模型组、梓醇低、中剂量组大鼠主动脉Nox4，p22phox mRNA表达均明显升高（P

3.7 Western-blot 法检测主动脉Nox4，p22phox蛋白表达 主动脉Nox4，p22phox蛋白表达见图6。与正常组比较，模型组、梓醇低剂量组主动脉Nox4，p22phox蛋白表达明显减少（P

4 讨论

血管收缩和舒张功能失调是血管内皮损伤和功能障碍的主要表现，是T2DM大血管病变的始动环节。高糖、高脂及氧化应激等因素均是导致T2DM血管内皮损伤的高危因素。本研究采用高糖高脂饮食联合小剂量STZ腹腔注射成功建立了T2DM大鼠模型，6周后T2DM大鼠血糖、血脂明显升高出现糖脂代谢紊乱，血清SOD活性明显降低，8-iso-PGF2α含量明显升高，主动脉ROS含量明显增加，出现明显的氧化应激反应。胸主动脉血管内皮舒缩功能障碍，HE染色发现胸主动脉内皮损伤明显。证实了糖脂代谢紊乱及氧化应激对T2DM血管内皮损伤的影响。梓醇是地黄的主要活性成分之一，具有降低血糖、保护神经等多种药理学作用。但梓醇对T2DM早期血管内皮功能是否具有保护作用国内外未见报道。本研究建立T2DM大鼠模型的同时给予梓醇干预治疗，研究发现，T2DM大鼠胸主动脉内皮损伤明显减轻，血管舒缩功能明显改善，血清NO水平明显升高，表明梓醇对2型糖尿病早期血管内皮功能具有明显的保护作用。本研究发现梓醇能够显著降低T2DM大鼠血糖，明显改善血脂代谢紊乱，提示梓醇可能通过降低血糖、调节血脂，保护T2DM早期血管内皮功能。

T2DM糖脂代谢紊乱均可引起氧化应激，导致ROS过度产生，ROS不能被及时清除而大量蓄积，造成各组织细胞损伤[11]。ROS是衡量机体氧化应激水平的主要指标，SOD则是反映机体抗氧化能力的常用指标，8-iso-PGF2α主要来源于磷脂中的花生四烯酸，近年来已成为评价体内氧化应激水平的金标准[12]。有研究发现梓醇能够减轻糖尿病大鼠氧化应激水平[13]。本研究也发现梓醇干预后T2DM大鼠血清8-iso-PGF2α水平及主动脉ROS 含量显著降低，而血清SOD活性明显升高，说明梓醇可能通过降低糖尿病大鼠体内氧化应激水平保护T2DM早期血管内皮功能。

目前认为NADPH 氧化酶是血管内皮细胞生成ROS的主要来源[14]，内皮细胞能够通过NADPH氧化酶产生的ROS来减少NO的生成，导致血管内皮功能紊乱[15]。NADPH 氧化酶包含gp91phox，p22phox，p47phox，p67phox，rac 等5个亚组分[16]，有研究报道，糖尿病患者几个NADPH氧化酶亚基（p22phox，p47phox，p67phox）表达是升高的[17]。Nox家族是gp91phox的同工酶有Nox1，Nox2，Nox3，Nox4，Nox5 等成员，其中Nox4定位于血管内皮细胞和平滑肌细胞。血管生理学认为，Nox家族是血管ROS的主要来源[18]。本研究发现T2DM大鼠主动脉p22phox 和Nox4 mRNA及蛋白表达显著升高，梓醇干预后p22phox 和Nox4 mRNA及蛋白表达明显下调，这可能是梓醇能够下调T2DM大鼠主动脉ROS水平的机制。

综上所述，本研究首次报道了梓醇对T2DM早期血管内皮功能具有保护作用，其机制可能与梓醇改善糖尿病糖脂代谢紊乱，提高机体抗氧化能力，通过下调p22phox 和Nox4 mRNA及蛋白表达减轻糖尿病大血管氧化应激损伤有关。

[参考文献]

[1] Fox C S， Coady S， Soriie P D， et al. Trends in cardiovascular complications of diabetes[J]. J Am Med Assoc， 2004， 292（20）：2495.

[2] 董， 陈长勋. 梓醇药理作用的研究进展[J]. 中成药， 2013， 35（5）： 1047.

[3] Huang W J， Niu H S， Lin M H. Antihyperglycemic effect of catalpol in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. J Nat Prod， 2010， 73（6）： 1170.

[4] Garcia C， Leon L G， Pungitore C R， et al. Enhancemet of antiprolifter activity by molecular simplification of catalpol[J]. Bioorg Med Chem， 2010， 18（7）： 2515.

[5] Xu G， Xiong Z， Yong Y， et al. Catalpol attenuates MPTP induced neuronal degeneration of nigrol-striatal dopaminergic pathway in mice through elevating glial cell derived neurotrophic factor in striatum [J]. Neuroscience， 2010， 167（1）： 174.

[6] Zhang Y W， Shi J， Li Y J， et al. Cardiomyocyte deaty in doxorubicin-induced cardiotoxicity[J]. Arch Immunol Ther Exp， 2009， 57（6）： 435.

[7] 陈萍， 王国贤， 魏慧芳. 梓醇对大鼠阿霉素心肌损伤的保护作用及其抗氧化机制研究[J].时珍国医国药， 2010， 21（7）： 1650.

[8] Hu L， Sun Y， Hu J. Catalpol inhibits appotosis in hydrogen peroxide-induced endothelium by activating the PI3K/Akt signaling pathway and modulating expression of Bcl-2 and Bax[J]. Eur J Pharmacol， 2010， 628（1/3）： 155.

[9] 黎静， 谢露， 杨晓梅， 等. 海带多糖对心理应激大鼠血管内皮依赖性舒缩功能的影响[J].中国动脉硬化杂志， 2012， 20（1）： 6.

[10] 徐叔云， 卞如濂， 陈修. 药理实验方法学[M].2版. 北京： 人民卫生出版社， 2002.

[11] Noh H， Ha H. Reactive oxygen species and oxidative stress [J]. Contrib Nephrol， 2011， 170： 102.

[12] Morrow J D. Quantification of isoprostanes as ind ices of oxidant stress and the risk of atherosclerosis in humans[J]. Arterioseler Thromb Vasc Biol， 2005， 25（2）： 279.

[13] Cheng-Fang Wang， Dan-Qing Li， Hong-Yu Xue， et al. Oral supplementation of catalpol ameliorates diabetic encephalopathy in rats[J]. Brain Res，2010， 1307（11）：158.

[14] MacCarthy P A， Grieve D J， Li J M， et al. Impaired endothelial regulation of ventricular relaxation in cardiac hypertrophy ： role of reactive oxygen species and NADPH oxidase[J]. Circulation， 2001， 104（24）：2967.

[15] Warnholtz A， Nicking G， Schulz E， et al. Increased NADH-oxidase mediated superoxide production in the early stages of atherosclerosis [J]. Circulation， 1999， 99（15）：2027.

[16] Brown D I， Griendling K K. Nox proteins in signal transduction[J]. Free Radic Biol Med， 2009， 47（9）：1239.

[17] Guzik T J， Mussa S， Gastaldi D， et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus： role of NAD （P） H oxidase and endothelial nitric oxide synthase[J]. Circulation， 2002， 105（14）：1656.

[18] Lassegue B， Griendling K K. NADPH oxidases： functions and pathologies in the vasculature[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2010， 30（4）：653.

Catalpol protect diabetic vascular endothelial function by

inhibiting NADPH oxidase

LIU Jiang-yue

（Department of Pathophysiology of Weifang Medical College， Weifang 261053， China）

[Abstract] The aim of the present study was to evaluate the protective effect of catalpol on vascular endothelial function in STZ-induced type 2 diabetes mellitus （T2DM） rats. 40 high-fat diet with STZ-induced diabetes rats were randomly divided into model group， catalpol low-dose， middle-dose and high-dose group （10，50，100 mg・kg-1・d-1）， 10 normal Wistar rats were used as the normal group. The normal and model groups were given an equivalent amount of saline. All reagents were administered by oral gavage for 6 weeks. After 6 weeks， blood glucose and lipids were detected by an automatic biochemical analyzer. The endothelium-dependent vasodilation response of thoracic aortar was detected. The pathological changes of the thoracic aorta were observed by HE staining. Serum nitric oxide （NO）， 8-iso prostaglandin F2α （8-iso-PGF2α） and superoxide dismutase （SOD） were detected by ELISA. Reactive oxygen species （ROS） level of thoracic aorta was detected by fluorescence method. The expression of Nox4 and p22phox mRNA and protein in aortic tissue were detected by RT-PCR and Western-blot respectively. After catalpol treatment， endothelial damage of thoracic aorta was attenuated significantly； ROS level of thoracic aorta and serum level of 8-iso-PGF2α were decreased significantly； serum NO and SOD levels were remarkably elevated； expression of Nox4， p22phox mRNA and protein in thoracic aorta were significantly reduced （P

[Key words] T2DM； endothelial function； oxidative stress； NADPH oxidase

doi：10.4268/cjcmm20141527