2萃取川西老鹳草中鞣质工艺优选'> 超临界CO2萃取川西老鹳草中鞣质工艺优选

[摘要] 该文利用超临界CO2萃取装置对川西老鹳草中鞣质的提取工艺条件进行优化。采用磷钼钨酸-干酪素比色法测定鞣质的含量，以萃取压力、温度和时间为考察因素，以川西老鹳草萃取物中的鞣质含量为评价指标，通过正交试验对工艺条件进行优选。试验所得最佳工艺条件为萃取压力25 MPa，萃取温度50 ℃，萃取1.5 h。提取物中鞣质质量分数为12.91 mg・g-1，浸膏产率为3.67%。该比色法可以作为川西老鹳草鞣质的含量测定的方法，优化后的工艺稳定可行，提取率高，可为川西老鹳草中鞣质的提取工艺设计提供理论依据。

[关键词] 川西老鹳草；鞣质；超临界CO2萃取；正交试验

[收稿日期] 2014-02-08

[通信作者] 童志平，副教授，硕士生导师，从事药物化学研究，E-mail：；谭睿，E-mail：

[作者简介] 谢松，Tel：15202867270，E-mail：

老鹳草具有祛风湿、通经络、止泄痢等功效，其主要化学成分包括鞣质、黄酮类、有机酸等，其中鞣质最为丰富，是其重要药效成分[1-3]。目前对老鹳草研究主要集中在牛儿苗、老鹳草或野老鹳草，而川西老鹳草为非正品药材，对川西老鹳草中鞣质有效成分提取工艺研究尚未见文献报道。

超临界CO2萃取具有萃取选择性好、萃取条件温和、提取效率高、无毒无残留、适于热敏性物质提取等优点，已被广泛应用于医药、食品、化工等领域[4-5]。本文以川西老鹳草中鞣质含量为考察指标，对影响鞣质萃取的压力、温度和时间3个主要因素进行优化，以建立最佳的萃取工艺条件，为进一步工业化生产提供参考，为川西老鹳草以及老鹳草植物资源的合理开发提供理论依据。

1 材料

SC5+1 L型超临界萃取装置（德阳四创科技有限公司），UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本岛津），BS110S型电子天平（北京塞多利斯天平有限公司），SK7200LH超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

川西老鹳草购于成都新荷花池中药材市场，经西南交通大学宋良科副教授鉴定为川西老鹳草Geranium orientali-tibeticum R. Knuth。没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号 110831-200803），CO2（成都世茂气体有限公司，纯度>99.9%），钨酸钠，钼酸钠，硫酸锂，盐酸，磷酸，干酪素试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液与标准溶液的配制

2.1.1 磷钼钨酸试液[5] 取钨酸钠100 g和钼酸钠25 g，加水700 mL使溶解，加盐酸100 mL和磷酸50 mL，加热回流10 h，再加硫酸锂150 g，水50 mL和溴水数滴，煮沸除去过多的溴，放冷，加水稀释至1 000 mL，滤过，即得。

2.1.2 碳酸钠试液[5] 称取碳酸钠145 g，加水定容至500 mL量瓶中，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 供试品溶液的制备 精密称取各萃取条件所得干浸膏0.5 g，置500 mL棕色量瓶，加水150 mL，超声溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，静置，过滤，取续滤液5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，备用。

2.1.5 总酚溶液 取供试品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，待用。

2.1.6 不被吸附的多酚溶液 取供试品溶液25 mL，加至已盛有0.6 g干酪素的具塞锥形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保温60 min，期间持续振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，待用。

2.1.7 干酪素溶液 称取干酪素0.6 g置于具塞锥形瓶中，加入25 mL水，密塞，置30 ℃水浴中保温60 min，期间持续振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，待用。

2.2 方法学考察

2.2.1 测定波长选择 分别取没食子酸对照品、总酚、不被吸附的多酚和干酪素溶液2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水10 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的溶剂为空白，在400～800 nm扫描。4种溶液均在758 nm处均有最大吸收，故确定以758 nm作为测定波长。

2.2.2 线性关系考察 取没食子酸对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 mL分别置25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水11.5，11.0，10.5，10.0，9.0，8.0 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以未加没食子酸对照品溶液为空白，在758 nm测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，以没食子酸对照品质量浓度（C）为横坐标，得回归方程为A=112.28C+0.008 1（r = 0.999 8），表明没食子酸质量浓度在1.0～8.0 mg・L-1线性关系良好。

2.2.3 精密度试验 取没食子酸对照品溶液连续测定6次，按2.2.2项方法测定吸光度，结果RSD 0.24%，说明所建立的方法精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按2.2.2项方法测定吸光度，每隔30 min测1次，结果样品溶液在180 min内稳定，RSD 1.4%。

2.2.5 重复性试验 精密称取同一样品6份，按2.1项下方法进行测定吸光度，计算鞣质量，RSD 1.3%，表明该测定方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的干浸膏约0.5 g（共6份），用移液管准确加入没食子酸对照品溶液（没食子酸质量浓度0.50 g・L-1）10 mL，照2.1项下方法测定吸光度。平均回收率为98.75%，RSD 1.5%，表明该方法稳定可行。

2.3 样品测定

2.3.1 总酚 精密量取供试品溶液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按上述方法测定吸光度，从标准曲线中求出样品中相当于没食子酸的量（mg），计算，即得。

2.3.2 不被吸附的多酚 精密量取供试品溶液25 mL加至已盛有0.6 g干酪素的具塞锥形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保温60 min，期间持续振摇，取出放冷，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按上述方法测定吸光度，从标准曲线中求出样品中相当于没食子酸的量（mg），计算，即得。鞣质量=总酚量-不被吸附的多酚量[7-8]。

2.4 正交试验

取川西老鹳草全草粉碎，过3号筛，称取川西老鹳草粗粉50.0 g置入1 L萃取釜中，加入100 mL乙醇作为夹带剂。设置好萃取压力和萃取温度后进行萃取，至规定时间后停止萃取。收集萃取产物，减压浓缩，浸膏干燥，称重，按2.1项下方法测定萃取物中鞣质的含量。选取萃取压力（A）、萃取温度（B）和萃取时间（C）3个影响超临界CO2萃取的主要因素进行考察，每个因素选3个水平，见表1。按表2进行正交试验，以萃取物中鞣质含量为考察指标进行分析，方差分析见表3。

由表2，3中鞣质含量的直观分析与方差分析可知，各因素对工艺的影响顺序为萃取压力>萃取时间>萃取温度。优选试验最佳水平组合方案为A3B3C2，即萃取压力25 MPa，萃取温度50 ℃，萃取时间1.5 h。

2.5 验证试验

称取川西老鹳草粗粉3份，每份50.0 g，按照正交设计优选的工艺参数条件进行验证试验，结果3次试验中鞣质浸膏提取率分别为3.76%，3.60%，3.64%，鞣质质量分数分别为12.86，12.97，12.89 mg・g-1，表明此提取工艺稳定可行。

3 讨论

鞣质为多羟基化合物，具有极性强，不稳定的特点，故本实验采用乙醇作为夹带剂，进行超临界CO2萃取。在单因素试验的基础上，以萃取压力、萃取温度、萃取时间3个因素进行正交试验优选，同时通过验证试验证明正交优选工艺条件较为简便、快速萃取鞣质的较佳工艺条件。本方法不仅为川西老鹳草中鞣质成分提取工艺提供实验依据，同时对提取其他含鞣质成分的中药提供借鉴依据。

鞣质也属多酚类化合物，在紫外区吸收比较弱，直接测定鞣质的含量偏差较大。本实验应用磷钼钨 酸-干酪素比色法，即在碱性溶液中磷钼钨酸与多酚类物质显色反应到呈蓝色产物，在758 nm波长处，分别测定供试品溶液的总酚和不被吸附的多酚的吸光度，用标曲法求出鞣质的含量。此方法能快速，灵敏，精确检测药材中鞣质的含量。

根据研究开发实践，超临界萃取技术应用中药材的提取，具有较大的潜力和可观前景，它可以大幅度地提高提取率，所得萃取物的纯度高，无有机物残留；在能耗方面，不仅节省溶剂而其极大地缩短了提取时间。本实验所用的超临界只配备5 L和1 L的萃取设备，如应用实际工业化生产还需进一步的放大验证试验。

[参考文献]

[1] 宋华. 老鹳草的药理作用研究进展[J]. 中草药，1997，28（10）：132.

[2] 梁永锋. 甘青老鹳草化学成分研究[J]. 中药材，2008，31（12）：1825.

[3] 雷海民，李强，柏冬，等. 粗根老鹳草化学成分的研究[J]. 中国中药杂志，2007，32（4）：348.

[4] 霍鹏，张清，张滨，等. 超临界流体萃取技术的应用与发展[J]. 河北化工，2010，33（3）：25.

[5] 左亚妹，田俊生，郭晓擎，等. 逍遥散超临界CO2提取工艺及提取物GC-MS特征图谱初步研究[J]. 中国中药杂志，2014，39（4）：674.

[6] 中国药典. 一部[S]. 2010：113.

[7] 王坤，鲁静. 中药材中鞣质含量测定方法的研究[J]. 中国药事，2004，18（6）：361.

[8] 沈洁，徐金钟，胡济宏，等. 磷钼钨酸-干酪素法测定丹参药材中鞣质的含量[J]. 分析化学研究简报，2008，4（36）：553.

Optimization of extraction process for tannins from

Geranium orientali-tibeticum by supercritical CO2 method

XIE Song， TONG Zhi-ping， TAN Rui， LIU Xiao-zhen

（School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China）

[Abstract] In order to optimize extraction process conditions of tannins from Geranium orientali-tibeticum by supercritical CO2， the content of tannins was determined by phosphomolybdium tungsten acid-casein reaction， with extraction pressure， extraction temperature and extraction time as factors， the content of tannins from extract of G. orientali-tibeticum as index， technology conditions were optimized by orthogonal test. Optimum technology conditions were as follows： extraction pressure was 25 MPa， extraction temperature was 50 ℃， extracted 1.5 h. The content of tannins in extract was 12.91 mg・g-1，extract rate was 3.67%. The method established could be used for assay the contents of tannin in G. orientali-tibeticum. The circulated extraction was an effective extraction process that was stable and feasible，and that provides a way of the extraction process conditions of tannin from G. orientali-tibeticum.

[Key words] Geranium orientali-tibeticum； tannins； supercritical CO2 extraction method； orthogonal test

doi：10.4268/cjcmm20141522