人体微生物与健康及其在法医鉴定中的新探索

摘?要 人体微生物群落是一个庞大而华丽的大家族，在平衡人体健康中扮演着重要的角色，另外，随着新一代测序技术以及宏基因组学研究的不断发展与深入，一方面微生物与人体之间交流机制进一步得到阐释，另一方面利用人体微生物群落进行法医鉴定也有了新的发现，本文对人体微生物与健康，在法医鉴定中的新探索，以及新技术进展包括焦磷酸测序、宏基因组研究等进行了综述。

关键词 人体微生物；焦磷酸测序；宏基因组；法医鉴定

中图分类号 R714 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)052-0120-02

从19世纪初的谈菌色变，到人类运用抗生素、疫苗等医疗手段来遏制微生物对人体所带来的疾病，再到近年来专注于人体微生物的各项研究，不断运用新的科学技术阐释人体微生物在维持人体健康中的重要作用。2007年美国国家卫生研究院（NIH）出资1.5亿美元正式启动“人类微生物研究计划”（HMP），旨在揭示人体健康、疾病状态与人体微生物之间的关系，另外，通过宏基因组学方法和新一代测序方法的相互作用，HMP将为进一步研究人体相关微生物群落奠定坚实的基础。

科学研究者的思维是缜密且发散的，在研究人体微生物维持人体健康的同时，任何新的发现都会有着科学的新思考，2010年，美国科罗拉多大学博尔德分校的研究团队通过人体皮肤微生物研究报道了其与法医鉴定之间的新发现，当人触摸物体时，会在物体表面留下手上的细菌，而研究结果证实这些细菌却是独一无二的，细菌的个体差异性相当显著，那么一定程度上就可像指纹那样用于身份识别。

1 人体微生物影响人体健康

人体正常微生物群是指栖息在人体皮肤或粘膜上并伴随宿主长期进化而形成的微生物群落。人体内部或体表活跃着超过200万亿个（约是人体细胞总数的十倍），总重量超过1千克（占人体总身体质量的1%～2%）的微生物个体，包括细菌、真菌和病毒等。微生物的生长需要特定环境，生理上近似的部位寄生的微生物也大致相同，而环境条件差异较大的区域，则生活着截然不同的菌群。健康的人体微生物群落在维持机体生物、化学、免疫屏障以及对宿主营养、健康、抵御致病微生物侵袭、抗肿瘤、抗衰老等方面发挥着重要的生理作用。当然，并非人体所有微生物都是有益的，我们知道，初生婴儿在分娩前体内是没有微生物的，此时婴儿的免疫系统尚不健全，根据最近美国一项研究表明，产道分娩和剖腹产的婴儿出生后所携带的微生物群落是不一样的，前者携带的细菌和母亲阴道里的微生物匹配，而后者携带的则是常见的皮肤微生物，这些微生物一方面在体内繁衍，另一方面帮助婴儿塑造免疫系统，但就在建立免疫系统的同时，一些有害菌则趁机而入，此时则需要发生激烈的斗争，健康菌群会战胜有害菌群，而那些生下来就体弱多病的婴儿很大程度上是由于携带了不够强大的健康菌群，所以孕妇阴道微生物构造与婴儿的初始微生物群落有很大关联。有些早产婴儿很容易受到胃肠道细菌的感染进而导致败血症、慢性腹泻和坏死性肠炎，当婴儿长到6个月大时，从开始在产道中携带着100种微生物到获得约700种微生物，到3岁时，每个孩子的身上微生物群构成和自身基因组一样，都是独一无二的，而每套成熟的微生物基因组也同时发挥着不可或缺的作用，增强了抵御外界环境病原菌侵袭的能力，维持健康，促进生长发育。

人体微生物影响着人体健康，共生菌能诱导产生某一免疫细胞，支持着人体的免疫系统，体内丰富的Faecalibacterium prausnitzi菌具有抗炎症作用，可以抵抗克罗恩病的复发，Bacteroides fragilis菌能够防止老鼠患结肠炎。根据06年在《自然》杂志上的一则报道，尼科尔森小组对同一种遗传品系的小鼠进行了喂药实验，在服食高剂量同种药物后，其中一组小鼠出现了肝中毒症状，而另一组小鼠则安然无恙。因为通过肠道微生物产生的尿液代谢物检测可以区分遗传特性高相似度的个体，所以得出结论，未中毒的小鼠肠道里的特定微生物群落将药物毒性进行了分解，从而保护了宿主。最近，此研究团队同样在《自然》杂志上报道了高血压与肠道菌群的组成具有密切的关系。不仅如此，戈登小组06年在《自然》杂志上同时报道了肠道微生物产生的某种因子很有可能是机体启动肥胖的必需物质。吉布森小组07年在《糖尿病》上报道了高脂食物显著减少了保护肠道屏障的有益菌如双歧杆菌，明显增加了可产生内毒素的细菌数量，导致进入血液的内毒素增加，最终导致一系列代谢紊乱疾病。人体结构异常的肠道菌群很可能是肥胖、高血压、糖尿病等因饮食结构不当造成的代谢性疾病的直接诱因。另外，有益菌补给是近年来宣传改善机体健康最为火热的一部分，但目前还没有确凿的科学证据显示益生菌补充剂或是含有益生菌的食物对健康的人有益，由于不同个体微生物群落存在差异，同样的摄入不一定有着同样的效果，有益有害，难以定论，当然，如果机体本身就有营养不良或者消化不良的症状，体内有益微生物群落的优势必然大大削弱，影响身体的健康。对于个体来说，精良健康的体内微生物群落会像一个清洁工，扫除体内的各种代谢垃圾，也像一台动力十足的马达，充分吸取营养物质精华，保持活力，提高新陈代谢能力。

近年来，基因组学的高速发展使我们能更准确高效的获得人体微生物的信息，在过去的5年里，美国国家卫生研究院的“人体微生物研究计划”和欧盟的“人类肠道宏基因组计划”已得到阶段性的实施，其研究思路都采用了新一代基因测序技术与宏基因组技术相结合的方式来探索人体微生物多样性对人体健康的影响，但技术的发展暂时还不能满足科学研究的迫切需要，目前的测序技术能力还不能识别全部的人体微生物群落，下面主要介绍人体微生物研究新技术的一些进展。

2 人体微生物研究新技术进展

2.1 16sRNA-识别微生物遗传信息的独特指纹

微生物rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。5S rRNA基因较短，呈现微生物多态性位点较少，而23S rRNA则较长，无法顺利进行测序，而16S rRNA长度适中约1500个nt，包含足够的遗传信息，且在所有的细菌中都存在，有8处高度保守区和9处可变区域，保守区序列有助于设计测序引物，而可变区序列用于分析种属关系，为鉴定与分类提供了便利，所以16S rRNA是微生物群落分析，进化及分类研究最常用的靶分子。通常情况下，实验时一般提取微生物DNA进行后续工作，因为rDNA是rRNA分子的对应的DNA序列，也就是编码16S rRNA的基因，DNA提取容易，也比较稳定，将测序完的16S rDNA序列信息上传到数据库中进行序列比对分析，序列相似性在98%以上的可以认为是同种，97%以上可以认为是同属，小于96%～97%的可以认为是不同种，小于93%～95%的可以认为是不同属。但比对出来的信息都是数据库中已有的物种信息，针对一些未知的或未发现的菌则无法检测出来。

2.2 焦磷酸测序技术

继sanger测序法之后，目前最为重要的测序技术就是焦磷酸测序技术（Pyrosequencing），其核心是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，这4种酶分别为：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶，反应底物为5′-磷酰硫酸、荧光素，反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团。焦磷酸基团可最终转化为可见光信号，并由焦磷酸测序仪器转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目是成正比的。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。焦磷酸测序技术的建立与应用使得高通量准确测定特征序列、有效进行微生物的分型鉴定成为可能。

2.3 宏基因组学研究

宏基因组（metagenome），指环境中全部微小生物遗传物质的总和，包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和，由Handelsman等1998年提出。而宏基因组学（metagenomics）是一种直接对无需培养的微生物多样性进行研究的方法，该方法直接提取特定环境中全部微生物的总基因组，并克隆到合适的可培养微生物宿主中，从而真实地反映该环境中微生物的多样性资料。简单地说，宏基因与16S rRNA有着显著的区别，宏基因针对整个环境中的所有微生物基因，为了检测环境中有哪些基因，而16S针对的是物种所属。宏基因组学的基本方法是分析微生物环境中的基因组组合，直接分离未培养微生物基因组DNA，将其克隆到可培养的微生物中，最后筛选出所需的。宏基因组学方法可以得到

16S rRNA的序列，但在确定细菌种属问题上的准确性不如特定用16S rRNA方法高。

3 人体微生物在法医鉴定中的新探索

21世纪末，法庭科学中作为生物物证之一的微生物物证检验逐渐兴起，微生物物证主要为细菌、病毒、真菌等可能涉及犯罪的微生物，其种类可分为三种：1）作为恐怖的生物武器，通过美国“911”之后的炭疽杆菌信件攻击事件，我们可以清楚的看到此类微生物制剂的非法传播将导致极为严重的后果；2）作为生物犯罪手段，生物犯罪是指故意使用致病微生物导致人、动物和植物发病，威胁人类健康，破坏农畜牧业发展和食品安全的犯罪行为，如艾滋病人故意传播艾滋病毒，导致他人患病等；3）作为犯罪的见证者，即微生物物证可在案犯实施犯罪过程中发生转移，将现场特定微生物与罪犯携带的部分相同现场微生物进行比对分析，可将嫌疑人与犯罪建立联系。

随着人体微生物研究的深入，一定程度上人体微生物扮演着犯罪见证者的角色。人的皮肤上生活着许多微生物，有细菌也有真菌，维持它们生存的营养物质便是人体汗液中的无机离子和有机物，平均每平方厘米的干燥皮肤上有1千个细菌，湿润的地方甚至多达1百万个，皮肤上的微生物容易被水洗脱，但洗脱后的8小时内又会迅速恢复到之前的正常稳定状态。2010年美国科罗拉多大学博尔德分校的一个研究小组做了这样一个实验，他们用无菌棉棒从3台电脑的键盘上提取到表面细菌，抽取细菌DNA后进行了焦磷酸测序，序列递交数据库比对后确定细菌种类，然后将被调查者的手上细菌进行同样处理，序列比对分析后，他们成功地找到了电脑的主人。另一实验中，研究人员同样提取了9个鼠标上的细菌，也成功地找到了其使用者。并且，在和人类手掌微生物数据库中的270份样品进行比较后，研究者发现鼠标上的细菌菌群样本更接近其使用者，另外，根据研究结果，研究者提出，每个人手掌微生物在承载客体上留下印记后，在室温下可保留两周，期间对承载客体上的微生物进行测序分析，和人手掌上的微生物相一致，这种细菌指纹可以将单独的个体从群体中分辨出来，并且不会出现误判的问题，利用个体的皮肤微生物群落存在显著差异性可以进行法医鉴定。细菌指纹相对于DNA指纹来说也有它的优势：一是在现场无法找到可以进行DNA鉴定的物质时，细菌取得较为方便；二是细菌作为人体第二套基因组，并没有泄露被检测人员自己的基因信息，符合法律和道德；三是作为一种新的鉴定方法，可对其他鉴定方法比如指纹鉴定做侧面的论证，其鉴定结果在一定程度上更加可靠可信。

4 结语和展望

综上所述，我们较为深刻地了解到人体微生物和人体健康有着密不可分的联系，很多疾病包括身体机能下降都和自身微生物群落失调有关，如何进一步建立一套完整的科学体系对人体微生物加以深入研究，留给了科学工作者更多更广泛的研究空间，另外，随着测序技术的不断成熟，测序成本不断降低，更多的基因信息终将浮出水面，目前难以解释的科学问题到时也会迎刃而解，但科学无止境，科学的发展总是在不断摸索的道路上前进的，期待有一天，通过科学调理自身微生物群落，我们的食欲会大增，吸收能力增强，不会过于肥胖或消瘦，保持健康的身体，精力充沛，远离亚健康。当然，在不久的将来，人体微生物作为新型的破案利器，我们不仅可以通过它找到罪犯，还可以通过现场遗留的微生物知道嫌疑人更多的身体秘密，比如他的生活习惯，身体健康程度等等，而这个秘密的告发者就是他自己，因为从出生那一刻起，微生物便要和他共度一生，形影不离。

参考文献

[1]Costello EK , et al. 2009. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science 326:1694-1697.

[2]Karen E. Nelson et al. 2010. A Catalog of Reference Genomes from the Human Microbiome. Science 21; 328(5981): 994-999.

[3]Elizabeth P. 2010. Body’s Hardworking Microbes Get Some Overdue Respect. Science. 330(6011): p. 1619.

[4]Fabrice A, Didier R. 2009. Exploring Microbial Diversity Using 16S rRNA High-Throughput Methods. J Comput Sci Syst Biol 2: 074-092.

[5]Michael Tennesen. 2011. The Trillions of Microbes That Call Us Home—and Help Keep Us Healthy. Discover magazine Health & Medicine.

[6]J. Gregory Caporaso et al. 2011. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108: 4516-4522.

[7]Hamady M, Walker J, Harris J, Gold N, Knight R. 2008. Error-correcting barcoded primers allow hundreds of samples to be pyrosequenced in multiplex. Nat Methods 5: 235-237.

[8]翟仙敦,刘之江,侯一平.焦磷酸测序技术及其法医学应用[J].中国司法鉴定,2009,45.

[9]Narayan Desai, Dion Antonopoulos, Jack A Gilbert, Elizabeth M Glass, Folker Meyer. 2012. From genomics to metagenomics. Current Opinion in Biotechnology 23:72-76.

[10]Junjie Q, Ruiqiang L et al. 2010. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. NATURE 464: 4.

[11]刘海燕.宏基因组学及在人体微生物研究上的应用[J].中国现代医学杂志,2012:1005-8982.08-0051-04.

[12]张幼芳.微生物物证检验进展[J].基础科学,2010:1674-6708.32-0134-01.

[13]Noah Fierer, Christian L. Lauber, Nick Zhou, Daniel McDonald, Elizabeth K. Costello, Rob Knight. 2010. Forensic identi-cation using skin bacterial communities. PNAS vol.107, no.14, 6477-6481.

[14]Valerie J McKenzie, Robert M Bowers, Noah Fierer, Rob Knight, Christian L Lauber. 2012. Co-habiting amphibian species harbor unique skin bacterial communities in wild populations. The ISME Journal 6, 588-596.

[15]Fierer N, Hamady M, Lauber CL, Knight R. 2008. The influence of sex, handedness, and washing on the diversity of hand surface bacteria. PNAS 105: 17994-17999.

作者简介

徐超（1985—），男，上海师范大学硕士研究生。

鞠冠华（1988—），女，上海师范大学硕士研究生。

张书（1988—），女，上海师范大学硕士研究生。