高效液相色谱法测定忍冬藤不同采收期中绿原酸和咖啡酸的含量

[摘要] 目的：建立高效液相色谱法测定忍冬藤不同采收期中绿原酸和咖啡酸含量的方法。方法：色谱柱为UltimateTM XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为0.3%-甲酸和乙腈（12∶88）；流速为1.0 ml/min；检测波长为327 nm；柱温为25℃。结果：绿原酸在2.5～125.0 μg/ml范围内呈良好线性关系；咖啡酸在1.2～60.0 μg/ml范围内呈良好线性关系；加样回收率为96.0%～104.6%。结论：应用新建立的方法测定了不同采收期忍冬藤中绿原酸和咖啡酸2种活性成分的含量，该法简单、快速、准确，可用于忍冬藤和叶的质量控制。

[关键词] 忍冬藤；采收期；高效液相色谱；绿原酸；咖啡酸

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2010）11（b）-051-02

Content determination of Chlorogenic acid and Caffeic acid in Caulis lonicerae during different collected periods by HPLC

LI Jiang

(Xuzhou Chinese Medicine Hospital, Xuzhou 221003, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for the content determination of Chlorogenic acid and Caffeic acid in Caulis lonicerae during different collected periods by HPLC. Methods: The UltimateTM XB-C18 column(4.6 mm×150 mm，5 μm) was used. The mobile phases consisted of 0.3% formic acid and acetonitrile(12∶88). The flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was set at 327 nm, column temperature was 25℃. Results: The linear ranges of Chlorogenic acid wasat 2.5-125.0 μg/ml and the linear ranges of that of Caffeic acid was at 1.2-60.0 μg/ml. The recovery rate was from 96.0% to 104.6%. Conclusion: The method is applied to the analysis of different collected periods Caulis lonicerae samples that came from different areas in China. The method is simple, rapid and accurate, and can be used for the evaluation of Caulis lonicerae.

[Key words] Caulis lonicerae; Collected periods; HPLC; Chlorogenic acid; Caffeic acid

忍冬藤为忍冬科植物忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）的干燥茎枝，具有清热解毒，疏风通络的功效，用于温病发热，热毒血痢等症状[1]。 现代化学、药理研究表明，忍冬藤中的主要活性成分为有机酸类。由于绿原酸具有一定的抗菌抗感染作用[2-4]，而且在忍冬藤中含量较高，为其主要活性成分之一，因此，对忍冬藤的质量控制研究仍主要以绿原酸的含量为指标[5-8]。但是，至今尚未见到忍冬藤中有关采收期的研究报道。本文基于中药中多成分、多靶点协调作用的特点，建立了HPLC-UV分析方法，同时对忍冬藤中绿原酸和咖啡酸进行分析测定，并应用该方法对忍冬藤的不同采收期样品进行了含量测定，为忍冬藤的采收期及质量控制提供了参考依据。

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱系统为Aglient 1100 HPLC system，包括在线脱气四元泵，自动进样器，紫外检测器，柱温箱，色谱柱为UltimateTM XB-C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；JP300型超声波提取器（武汉嘉鹏电子有限公司）；十万分之一电子天平（瑞士梅特勒电子天平）。

1.2 试药

绿原酸对照品和咖啡酸均购于中国药品生物制品检定所。实验用水（农夫山泉矿泉水），甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯。忍冬藤不同采收期样品由我院制剂中心植物园采集，经鉴定为忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥藤茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：A相为0.3％甲酸，B相为乙腈，流速：1.0 ml/min，检测波长：327 nm，柱温：25℃，洗脱条件：12∶88（甲酸水-乙腈）。理论塔板数按绿原酸计算，应不低于2 000。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取忍冬藤药材粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，加25 ml 50%甲醇（v/v），超声提取30 min，再用50%甲醇补重，药液过微孔滤膜（0.45 μm），进样10 μl，进行测定。

2.3 标准曲线的制备

精密称取各对照品适量，置于5 ml量瓶，甲醇溶解，定容，配制成1 mg/ml的混和标准品贮备液。精密吸取混和标准品贮备液适量，按上述色谱条件进行分析测定，以峰面积值（Y）为纵坐标，对照品实际进样量（X）为横坐标，进行回归计算。绿原酸的标准曲线：Y=2 241.5X+9.8（r=0.999 6）， 线性范围为2.5～125.0 μg/ml。咖啡酸的标准曲线：Y=3 635.3X-7.5（r=0.999 5）， 线性范围为1.2～60.0 μg/ml。结果表明，2种成分在检测范围内线性关系良好。

2.4精密度试验

取混合对照品溶液，按样品测定项下色谱条件进行HPLC分析，重复进样5次，进样量为10 μl，记录峰面积，计算含量的相对标准偏差（RSD），RSD小于2.0%，结果表明日内精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取同一采收期的5份相同的忍冬藤样品粉末，按照样品测定项下方法进行测定，得到相应的峰面积，计算出药材中各成分含量，其RSD小于2.5%，重现性良好。

2.6 稳定性试验

精密称取忍冬藤药材粉末1.0 g，按样品测定项下方法进行测定，每3小时测定1次，共测5次，计算峰面积的RSD，RSD小于3.0%，表明样品具有良好的稳定性。

2.7 加样回收率试验

精密称取0.50 g的5份已知含量的忍冬藤药材粉末，分别加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试液并分析，加样回收率在96.0%～104.6%，RSD小于4.0%。

2.8 样品含量测定

按“2.2”项下方法制备样品，进样10 μl，计算含量，色谱图见图1， 结果见表 1。

表 1忍冬藤含量测定结果（n=3）

Tab.1 Results of content determination of Caulis lonicerae (n=3)

3 讨论

3.1 提取方法及溶液稳定性的考察

笔者考察了超声提取、回流提取、索式提取三种提取方法，含量测定结果相当，超声提取时间短，故采用超声提取法制备样品。酚酸类溶液随着时间的放置，会变得不稳定，但放在棕色瓶中，在24 h内基本是稳定。

3.2 含量测定结果

从表1的含量测定结果来看，忍冬藤的不同采收期内，绿原酸的含量普遍高于咖啡酸的含量。比较不同的采收期可以发现，不同时期药材中化合物的含量存在很大的差异。如在九月至十二月的采收期内，十月采收的样品含量较高，十二月采收的较低。故选择不同的采收时间，对忍冬藤的质量控制至关重要。

本文建立和测定了忍冬藤不同采收期中酚酸类活性成分含量的HPLC方法，该测定方法的精密度、重复性及稳定性均较好，并利用建立的分析方法成功的测定了忍冬藤不同采收期药材的含量，说明该方法可以用于忍冬藤的质量控制。

[参考文献]

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（收稿日期：2010-09-21）