慢性乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞TRAIL mRNA水平的临床研究

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摘 要 目的：探讨慢性乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）mRNA的水平变化及其临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR反应检测实验组和健康对照组外周血单个核细胞TRAIL mRNA的水平，比较实验组和健康对照组之间TRAIL mRNA水平差异。结果：慢性乙型重型肝炎患者PBMC TRAIL mRNA的水平明显高于健康对照组（P

关键词 慢性乙型重型肝炎 外周血单个核细胞 可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体

doi：10.3969/j.issn.1007—614x.2012.29.189

Abstract Objective：To explore the role of TRAIL in the pathogenesis of HBV infection in CHB severe hepatitis.Methods：The expression of membrane—bound TRAIL in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）was examined by real—time fluores—cence quantitative PCR.Results：The levels of TRAIL mRNA in PBMCs were significantly higher in CHB severe hepatitis than in normal controls（P

慢性乙型重型肝炎属于乙肝病毒感染所致的免疫介导性疾病。研究表明许多凋亡分子参与了重型肝炎肝脏病理损伤过程，如Fas/Fas配体系统、TNF—α/TNF—R1系统、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体/配体系统等，而TRAIL受体/配体系统的作用日益引起关注1。为进一步探索慢性乙型重型肝炎患者外周血PBMC的TRAIL mRNA水平与重型肝炎肝脏病理的关系，本研究采用实时荧光定量PCR反应检测慢性乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞TRAIL mRNA的水平并进行相关性分析。

资料与方法

2011年5月～2012年3月收治慢性乙型重型肝炎患者22例，诊断参照2000年西安全国病毒性肝炎会议修订的临床诊断标准，并排除其他类型的病毒性肝炎或其他原因的肝病。其中男16例，女6例，年龄20～60岁。20例本院健康体检者作为健康对照。应用TRIzol提取液、pGEMT—Easy载体、质粒提取试剂盒、dNTPS、Super—Script TMⅢ逆转录试剂盒均。采用实时荧光定量PCR仪。

实时荧光定量PCR反应检测PBMC TRAIL mRNA的水平：按TriZol试剂说明书抽提慢性乙型重型肝炎患者的外周血单个核细胞总的RNA，按Super—Script TMⅢ试剂说明书进行逆转录，将mRNA逆转录成cDNA分子。以适量cDNA为模板，PCR扩增TRAIL基因片断。TRAIL上下游引物为5′—CCCAATGACG AAGAGAGTATGAAC—3′。5′—TGTA GAA ATGGTTTCCTCAGAGGT—3′。2M上下游引物为5‵—TCCATCCGACATTGAAGT TGAC—3′、5′—ACTATCTTGGGCTGTGACAAAG—3′。PCR反应参数：94℃ 3分钟、94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒共35个循环，72℃ 5分钟。扩增均设置阴性对照。根据各自标准品建立标准曲线，由软件自动分析测定样本中TRAIL含量。

统计学处理：求得各组结果的平均值和标准差表示样本水平。采用方差齐性比较两样本均数间差异，如方差相等则利用t检验进行，指标间相关性采用直线相关分析。

结 果

慢性乙型重型肝炎患者PBMC TRAIL mRNA水平明显高于健康对照组（P

讨 论

细胞凋亡与重型乙型肝炎发病机制的关系正受到人们的重视。许多凋亡分子已被发现参与此过程。TRAIL为继TNF、FasL之后发现的第3个TNF超家族的凋亡分子。Mundt等发现2，腺病毒感染鼠肝炎模型中，腺病毒感染可以激活TRAIL诱导肝细胞凋亡，并推测TRAIL诱导细胞凋亡可能在病毒性肝炎中发挥重要作用。他们还发现HBV感染的患者肝组织TRAIL表达增高。

TRAIL被认为是机体有效的免疫监视分子3，在机体的免疫调节和肿瘤凋亡中起着重要的作用。本试验表明慢性乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞中TRAIL mRNA表达显著上调，高于正常对照组，提示在慢性乙型重型肝炎病理损害过程中同样存在TRAIL介导的细胞凋亡，TRAIL水平能敏感地反映患者的肝脏损伤程度。我国重型肝炎主要是由于病毒感染所致，慢性乙型重型肝炎属于乙肝病毒感染所致的免疫介导性疾病，TRAIL受体/配体系统及其他众多的凋亡分子在病理状态下被激活参与机体的免疫反应。HBV激活TRAIL的表达，在细胞因子的作用下，能够及时清除突变细胞和转化细胞，限制病毒复制对机体起着重要的防卫作用4。但同时TRAIL也存在损伤肝脏，破坏肝细胞的可能性，在杀伤靶细胞的同时也有可能加剧肝脏的损伤。肝细胞破坏增多，肝脏的解毒功能下降，从而使体内内毒素（LPS）降解减少。肠源性内毒素进入体循环，又刺激外周血免疫细胞如单个核细胞、淋巴细胞等，使其表达TRAIL增多，PBMC TRAIL mRNA表达增