利塞膦酸盐及其有关物质高效液相色谱优化分离条件的选择

【摘要】目的：采用蒸发光散射检测器，反相离子对高效液相色谱法研究利塞膦酸盐及其有关化合物的色谱分析与分离方法。方法：优化的分离条件是以C8柱为固定相，甲醇-5mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（含6mmol/L四丁基溴化铵溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0）（体积比为20：80）为流动相，等度洗脱，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为240nm，柱温为30℃。结果：在该色谱条件下，利塞膦酸盐与有关化合物分离良好，符合要求。结论：该方法不需进行复杂的样品处理，适用于利塞膦酸盐的质量控制。

【关键词】反相离子对高效液相色谱； 利塞膦酸盐

【中图分类号】R284.2 【文献标识码】B【文章编号】2095-6851（2014）2-0450-01

基金项目：河北省2011年医学科学研究重点课题项目（20110548）

双膦酸类药物（包括双膦酸和双膦酸盐）含有两个膦酸基团，因而极性太强，不能在C8、C18等非极性色谱柱上保留，其色谱分析方法多采用离子交换高效液相色谱法[1-4]。这些方法大多以价格昂贵的耐强碱或耐强酸的阴离子交换柱作为固定相，且需要梯度洗脱，分离效果及重现性差，操作繁琐耗时。本文所建立的反相离子对高效液相色谱法，通过在流动相中加入离子对试剂四丁基溴化铵，使得利塞膦酸盐及其有关化合物在反相色谱柱上保留，通过优化色谱条件，采用等度洗脱方式便达到了很好的分离。方法不需要复杂的样品处理过程，适用于利塞膦酸盐原料药、制剂的常规检验以及有关化合物的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂：液相色谱仪系统包括SP8810型输液泵、SP8450型紫外可见检测器（美国光谱-物理公司）、HW-2000色谱工作站（南京千谱软件有限公司）。利塞膦酸盐、2-（3-吡啶）乙酸均由河北医科大学药学院提供；四丁基溴化铵、磷酸二氢钠均为分析纯试剂；试验用水均使用二次重蒸水；甲醇为色谱纯试剂。

1.2 色谱条件：色谱柱： Hypersil C8柱（150mm×4.6mm i.d.，5μm）（大连依利特科学仪器有限公司）。流动相：甲醇-5mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（含6mmol/L四丁基溴化铵溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0）（体积比为20：80），流速：1.0mL/min。检测波长：240nm 。进样量：20μL 。柱温：室温。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择：分别以Hypersil C8和Hypersil C18柱作固定相，考察磷酸二氢钠缓冲液浓度（5mmol/L ）、流动相pH值（7.0）及甲醇的体积分数（20%）一定时，增加流动相中离子对试剂（同时有减尾剂的作用）四丁基溴化铵浓度对利塞膦酸盐峰形的改善情况。结果显示，以Hypersil C8作固定相，增加离子对试剂浓度，峰形得到明显改善，能够满足要求，因此最终以Hypersil C8柱作为固定相。

2.2 影响色谱行为的因素考察

2.2.1离子对试剂浓度的影响 当磷酸二氢钠缓冲液浓度（5mmol/L）、流动相pH值（7.0）及甲醇的体积分数（20%）一定时，随着四丁基溴化铵浓度的增加，二者的保留都呈现出增加的趋势。当四丁基溴化铵浓度大于6mmol/L时，利塞膦酸盐保留增加的趋势趋于缓慢。最终选择四丁基溴化铵的浓度为6mmol/L，在此条件下，二者的分离良好。

2.2.2 有机改性剂比例的影响 当四丁基溴化铵的浓度（6mmol/L）、磷酸二氢钠缓冲液浓度（5mmol/L）及流动相pH值（7.0）一定时，加入体积分数为5%～25%的甲醇。结果发现，随着甲醇体积分数的增加，洗脱能力增强，最终选择甲醇的体积分数为20%。

2.2.3 缓冲液浓度的影响 在6mmol/L四丁基溴化铵、及20%甲醇条件下，随着磷酸盐缓冲液浓度的增加，二者的保留均减弱。为了保证良好的分离及合适的保留时间，最终选择磷酸盐缓冲液的浓度为5mmol/L。

研究结果表明，在上述优化的分离条件下，利塞膦酸盐与其有关化合物有合适的保留时间并有较好的分离。利塞膦酸盐和有关化合物的分离情况良好，与保留时间最接近的杂质峰的分离度大于2.5。

参考文献

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作者简介：张立峰，男，硕士，副教授*为通讯作者：张立峰