胎鼠听囊细胞体外培养研究

作者：刘晖，程随涛，许珉，梁建民，马伟军

【关键词】 听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠

【Abstract】 AIM: To find the origin of auditory cells in mammals and to study the proliferation and differentiation of auditory cell progenitors. METHODS: Otocyst epithelia surgically isolated from fetal rats were cultured and passaged. Proliferation and differentiation of cultured cells were observed using BrdU labeling to find the progenitors. Immunocytochemistry (Factin, cytokeratin and calretinin) was used to detect cell properties of cultured cells. RESULTS: Otocyst cells differentiated and proliferated and showed several morphotypes, mainly including epitheliallike cells, fibroblastlike and neuronlike cells. All of cells were labeled positive to Factin and cytokeratin. A subset of cells were labeled strong positive by calretinin in primary culture. But few passaged cells were positive to calretinin. BrdU labeling showed cultured cells could proliferate significantly. The morphological phenotype was retained throughout 8 passages during 4month culture. CONCLUSION: In natural culture condition in vitro, otocyst cells of fetal rats can differentiate or proliferate to immature hair cells. The study will provide some ideas and methods for further research about hair cell regeneration.

【Keywords】 otocyst cells; stem cells; cell proliferation; differentiation; fetal rats

【摘要】 目的： 了解哺乳动物听觉细胞的来源，探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化. 方法： 取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养，用免疫细胞化学方法，分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F肌动蛋白和calretinin染色观察细胞特征；BrdU染色观察细胞增殖. 结果：培养的细胞在体外进行分化和增殖，细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种. 对细胞角蛋白和F肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性. 在原代培养就出现calretinin染色明显阳性的细胞. 传代后结果仍为阳性着染，但强度减弱. BrdU染色显示培养细胞具有明显的增殖活性. 本研究共传8代，历时4 mo，细胞形态维持稳定. 结论： 胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞. 本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.

【关键词】 听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠

由噪声、耳毒性药物等引起的耳蜗毛细胞损害而致的感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科难治之症. 如果能够建立一种细胞系，而这种细胞系又具有分化为听觉毛细胞的潜能，不但有利于听力学研究，也有利于进行药物的发展及毛细胞生物学方面的研究. 我们对胎鼠听囊细胞用自然培养方法进行体外培养，并应用免疫细胞化学方法，对培养细胞进行了染色标记和观察.

1材料和方法

1.1材料选用怀孕14 d成年健康小鼠1只，灰色，体质量0.15 kg. 耳廓反射正常，鼓膜正常. 细胞培养基DMEM（Gibco公司）；100 mL/L胎牛血清（FBS）（Sigma, USA）；2.5 g/L胰酶（Sigma, USA）；抗calretinin mAb( 1∶100 Chemicon 28820 Single Oak Drive. Temecula, CA 92590，USA）；鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（1∶200），抗F肌动蛋白单克隆抗体phalloidinFITC（1∶200）和鼠抗体Cy3均购自Sigma公司；BrdU试剂盒（Germany）.

1.2方法

1.2.1听囊制备引颈法杀死实验孕鼠，取出子宫，置入放有DMEM培养液的培养皿中. 用两只无菌镊撕开子宫，使胚胎与子宫内膜和胎盘游离，放入有新鲜培养液的培养皿中. 在解剖显微镜下仔细分离听囊，放入准备好的培养液中进行培养. 本次实验共取出胎龄为14 d的小鼠胚胎9只.

1.2.2听囊细胞培养14个胚胎听囊上皮组织（7胚）置入PBS液中清洗2次，在显微镜下用小剪刀剪碎组织，放入含有2.5 g/L胰酶的PBS液中37℃ 消化8 min，吸液管上下吹打20次，然后加入含100 mL/L胎牛血清（FBS）的DMEM液中终止消化；细胞悬液经离心后弃上清，加入培养液观察. 培养液包括DMEM； L谷氨酰胺，100 mg/L氨卞青霉素和100 mL/L胎牛血清（FBS）. 细胞悬液加入24孔培养板中在37℃, 50 mL/L CO2孵箱中孵育（部分培养孔放置有盖玻片），每3~4 d更换培养液. 相差显微镜下（Nikon，日本）观察.

当细胞汇合贴壁，细胞融合达80%以上时，应用2.5 g/L胰酶EDTA法消化5 min，进行传代. 将分离的细胞用含100 mL/L胎牛血清（FBS）的DMEM液进行倍数递增稀释，直至细胞浓度稀释至20×103/L，然后进行传代培养.

1.2.3免疫细胞化学染色① 抗细胞角蛋白染色: 载有培养细胞的盖玻片在40 g/L多聚甲醛中（0.1 moL/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4）固定30 min，用含100 mL/L山羊血清，1 mL/L Triton X100的PBS液阻断20 min后，抗细胞角蛋白（cytokeratin）mAb (1∶200) 进行孵育，4℃过夜. DPBS液洗3次，加入二抗(1∶200)，黑暗中孵育2 h，洗3次，100 g/L甘油封片. 在荧光显微镜下观察. ② F肌动蛋白的染色观察: 室温下培养物中加入0.5 mg/L phalloidinFITC(1∶200)孵育45 min. 立即在荧光显微镜下观察. ③ 抗calretinin染色: 载有培养细胞的盖玻片在40 g/L多聚甲醛中（0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4）固定30 min，用含100 mL/L山羊血清，1 mL/L Triton X100的PBS液阻断20 min后，抗calretinin mAb (1∶100) 进行孵育，4℃过夜. DPBS液洗3次，加入二抗(1∶200)，黑暗中孵育2 h，洗3次，100 g/L甘油封片. 在荧光显微镜下观察. ④ BrdU标记: 培养的细胞中加入BrdU（1∶1000; 5BrdU labeling and detection kit II Boehringer Mannheim GmbH Biochemica D68298 Mannheim Germany），其浓度为10 μmol/L. 37℃, 50 mL/L CO2孵育12 h后，用700 mL/L乙醇在-20℃固定30 min，加入1∶10抗BrdU mAb (克隆 BMC 9318, IgG1)，在37℃孵育30 min. 培养物置入含1∶200羊抗鼠抗体Cy3的PBS 液中90 min（避光状态）. 100 g/L甘油封片，显微镜下观察.

2结果

2.1听囊细胞培养14孔细胞中有11孔细胞生长良好，大部分细胞在培养8 h后贴壁，细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种（图1）.

图1胎鼠听囊细胞原代培养8 h，视野中可见到上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态×100

2.2听囊细胞传代培养本研究共传8代，历时4 mo，细胞形态仍主要为上皮细胞形态和成纤维细胞形态（图2）.细胞形态和结构比较稳定.

图2胎鼠听囊细胞培养1代第6日，细胞形态仍主 要为上皮细胞形态和成纤维细胞形态×200

2.3免疫细胞化学染色观察虽然培养的听囊细胞形态有多种变化，但对细胞角蛋白和F肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色均呈阳性. 本研究可见到培养第4日细胞就增殖形成细胞克隆，细胞角蛋白（图3A）染色呈阳性；传代细胞中，进行细胞角蛋白（图3B）染色，结果仍表现为阳性，说明传代后上皮细胞特征维持稳定. 研究中也可见到在传代后的细胞中，F肌动蛋白染色呈阳性（图3C）.

Calretinin是一种钙联蛋白，是早期毛细胞的标志［1］. 对培养的听囊细胞进行calretinin染色，在原代培养就出现明显阳性的细胞（图3D）. 这些细胞在传代后进行calretinin染色，结果仍为阳性着染，但强度减弱（图3E）. 为了证实细胞培养过程中有丝分裂的存在，本研究应用了BrdU进行细胞核标记（图3F），显示细胞具有明显的增殖活性.

A：胎鼠听囊细胞原代培养第4日，形成了细胞克隆，细胞角蛋白的免疫荧光染色×100； B：胎鼠听囊细胞5代，细胞角蛋白的免疫荧光染色×200； C：胎鼠听囊细胞1代第14日，F肌动蛋白的免疫荧光染色×100； D：胎鼠听囊细胞原代培养第7日，calretinin的免疫荧光染色×200； E：胎鼠听囊细胞培养1代第3日，calretinin的免疫荧光染色×200； F：胎鼠听囊细胞培养6代，细胞BrdU染色显示几乎所有培养细胞标记阳性×100.

图3免疫细胞化学染色观察

3讨论

有关毛细胞再生的研究已经进行了10余年. 目前，普遍的观点认为，鱼类和两栖类动物耳内终生都有毛细胞的产生，尤其是鸟类的前庭器官，有损伤后自我修复的功能. 哺乳动物毛细胞在出生后就已经停止增殖，不可能再产生. 近年来的许多研究成果令人鼓舞，已证实哺乳动物毛细胞的再生能力，但这些现象大部分是在自然恢复的过程中观察，急需探明毛细胞增殖和分化的来源. 大部分小鼠胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂是在胚胎15 d左右，经过终末有丝分裂后分化为毛细胞. 本研究的目标为在胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂之前，取出听囊（胚胎14 d），观察并培养听囊细胞，即毛细胞的前体细胞，从而了解这些前体细胞在体外自然培养条件下的增殖和分化情况.

以往许多研究者应用H2kbtsA58转基因动物进行永生化细胞系建立的研究，但是由这种转基因动物建立的永生化毛细胞前体细胞系有一定的缺陷：首先，这种动物的基因发生了变化，很容易发生进一步的突变，从而限制了它们在分子基因和细胞再生方面的研究；其次，这种转基因动物建立的永生化细胞系不可避免的改变了细胞本身的一些特点. 正是基于以上原因，本实验选取胚胎14 d的鼠胚听囊上皮细胞进行体外自然培养，不带有任何转化基因. 细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态，而且这种形态在细胞传代后基本维持稳定. 部分细胞在培养过程中形成了细胞克隆. 用免疫细胞化学方法进行细胞染色后发现，原代和传代细胞对上皮细胞标志F肌动蛋白和细胞角蛋白均表达阳性. 而早期毛细胞的标志calretinin在原代培养中表达强阳性，说明胚胎听囊细胞离体后可以直接分化为有具有毛细胞特征的细胞. 这一结果与新生鼠和成年鼠的毛细胞前体细胞研究中有相似的发现［2-4］.

干细胞的研究一直是近年研究的热点，在对哺乳动物毛细胞前体细胞的研究中，研究者也发现了一些干细胞存在的证据 ［5］. 尤其是Li等［6-7］的研究发现成年小鼠的前庭上皮中有一些表达干细胞标志的细胞，这些细胞可以分化为毛细胞样的细胞，具有替代丢失的毛细胞的潜能. Ito等 ［8］ 的研究也证实神经干细胞可以适应耳蜗的内环境，表现出毛细胞的形态. 本研究在进行终末有丝分裂之前得到的前体细胞在体外的表现也有几个干细胞的特点： ① 可以增殖分裂，BrdU染色阳性也说明这些细胞处于有丝分裂过程中；② 有类似的细胞克隆出现；③ 细胞可以分化为具有毛细胞特征的细胞. 虽然传代细胞仍然具有上皮细胞的特征，在对这些细胞进行calretinin染色后发现，细胞的阳性程度减弱. 所以，需要进一步的实验证实毛细胞干细胞的存在. 研究中培养的毛细胞前体细胞不但可以进行耳蜗基因方面的功能研究，也将为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.

【参考文献】

［1］ Zheng JL, Gao WQ. Analysis of rat vestibular hair cell development and regeneration using calretinin as an early marker［J］. J Neurosci, 1997,17:8270-8282.

［2］ Zhai S, Shi L,Wang BE, et al. Isolation and culture of hair cell progenitors from postnatal rat cochleae［J］. J Neurobiol, 2005,65(3):282-293.

［3］ Liu H, Li SL, Zhu HL, et al. Hair celllike cells generation induced by nature culture of cochlear sensory epithelia in rat［J］. Chinese J Otology, 2003,1(3):1-5.

［4］刘晖,朱宏亮,李胜利，等. 成年鼠耳蜗听觉细胞自然培养诱导毛细胞样细胞的产生［J］. 中华耳鼻咽喉杂志，2004,39（7）：438-439.

［5］ Zhao HB. Longterm natural culture of cochlear sensory epithelial of guinea pigs［J］. Neurosci lett, 2001,315:73-76.

［6］ Li HW, Liu H, Heller S. Pluripotent stem cells from themouse inner ear［J］. Nature, 2003, 9(10):1293-1299.

［7］ Li HW, Roblin G,Liu H , et al. Generation of hair cells by stepwise differentiation of embryonic stem cells［J］. PNAS, 2003,100(23 ):13495-13500.

［8］ Ito J, Kojima K, Kawaguchi S. Survival of neural stem cells in the cochlea［J］. Acta Otolaryngol, 2001,121:140-142.