植物细胞核分离纯化的探讨

摘 要：扼要综述了植物细胞核的分离制备技术，阐述了实验环节的关键点，分析了制备植物细胞核存在的主要问题，并提出了解决方法。

关键词：植物；细胞核；分离；纯化

植物细胞非对称融合、染色体杂交育种、大片段基因组文库构建、DNA纤维制备、细胞核中DNA、RNA、蛋白质含量的分析及染色质结构分析等，需要分离纯化出较多个体完整，分散较好的细胞核。学者们曾尝试用不同方法进行植物细胞核的分离，比如大豆、玉米、水稻、烟草、小麦、棉花、长春花、杉木等细胞核的分离或纯化近来又有过报道[1-7]，但由于不同植物材料由于结构和组分的不同，所以适合一种植物的细胞核制备方法并不适合于其它植物。本文就一些分离纯化植物细胞核的方法进行探讨。

对动物细胞核的分离纯化已经有了比较好的方案可查，然而对植物细胞却不尽然。主要是由于植物细胞在结构与内含物等方面显著不同于动物细胞，植物细胞除了具有细胞壁外，还含有胞间连丝和次生代谢物，这就给细胞核的制备增加了难度。分离纯化细胞核需要在材料选择、预处理、提取液选择、细胞的破碎方法及纯化方法上做综合考虑。

1 材料选择

制备植物细胞核一般可以选择愈伤组织、下胚轴、子叶、悬浮培养细胞和叶片等材料，其中选择后者居多。然而，愈伤组织和悬浮培养细胞有着自身的优越性。愈伤组织和悬浮培养细胞取材方便，本身就是无菌材料更便于做融合、杂交试验。离体培养的植物细胞更易于进行同步化处理，且黑暗下培养的细胞基本不含叶绿体，这些都便于核的纯化。

2 预处理

处于不同细胞周期的细胞核的大小是不同的，体积可相差几倍之多，为了便于纯化、提高收率，可先将用于制备细胞核的植物材料进行同步化处理。通常可采用低温（用冰水混合物）培养12h-48h的物理方法；也可采用使用羟基脲、8-羟基喹啉（0.001M-0.004M）或秋水仙素（0.01%-0.5%）的化学方法，处理时间在4h-24h。对于离体培养材料，还可以尽量缩短继代的周期使得细胞经常处于对数增殖期的办法使细胞核尽可能均匀一致。对于悬浮培养细胞还应在破碎细胞之前去除漂浮的已自溶的细胞碎片等杂质。

3 细胞破碎方法

主要有研磨法、刀切法、酸解法和酶解法。研磨法提取植物细胞核， 在研磨过程中酚类等物质易氧化， 不可避免的对提取细胞核产生影响， 细胞核提取质量不高。研磨时间长短和力度大小难以掌握，致使很多细胞核被破坏， 产率较低。刀切法，一种是用剪刀将叶片快速剪碎，另一种是用锋利刀片在放置于冰上的培养皿中于将叶片切碎至尽量细小的匀浆状。刀切法的操作手法也不容易保持一致，不适用于愈伤组织、悬浮细胞和根茎尖等材料。酸解法一般采用1M-3M盐酸解离细胞。酸解法效果不稳定。酶解法是利用纤维素酶、果胶酶和/或半纤维素酶等处理细胞。酶浓度在0.5%-2%，纤维素酶浓度高于果胶酶，半纤维素酶有助于纯化过程，不添加也可。使用蜗牛酶没有看到更好的结果。酶解时间为4h-24h。酶解法可以先得到原生质体，再通过挤压低渗涨破质膜或添加表面活性剂溶膜而释放细胞核，也可以不收集原生质体，一步实现收获细胞核，而且不必使用表面活性剂，这时需要延长酶解时间（12h左右）并使材料处于震荡当中。利用酶解法制备植物细胞核收获量较大，当然收获量的大小还与所用的提取液（酶解液）的其它成分密切相关。

4 提取液

可以使用缓冲盐或非缓冲盐。缓冲盐常被选用的包括Tris、MES、HEPES、MOPS和柠檬酸等，浓度在0.015-0.2M，pH7.0-8.0居多，也有使用pH2.0-3.0的。提取液中可选择添加的成分比较多，比如Mg2+、K+、Na+、精胺、TritonX-100、Tween20、EDTA、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、PVP、β-巯基乙醇、DTT、PMSF、抗坏血酸等。这些成份能够稳定核染色质（体）、提供一定的离子强度、维持渗透压、促进细胞核释放，移走细胞质，分散叶绿体，减少核粘连、防止细胞核被氧化、减轻酚类等次生物质的干扰，提高细胞核质量。这些成份用量在0.1mM-0.6M，其中糖类物质用量大。

5 分离纯化方法

过滤、差速离心和密度梯度离心是最常用的方法。细胞破碎以后通常需要过滤。过滤常利用不锈钢、尼龙网（120目-400目）和过滤棉等。差速离心需多次反复沉淀和再悬浮，容易使核破裂。沉淀核的离心速度很低即可，如果离心时间过长和速度过高， 虽然会提高核的产量， 但也会增加其他非核材料的沾染。密度梯度溶液多用蔗糖、甘露醇和Percoll。浓度高的蔗糖溶液是非常粘的， 而且这种溶液的粘度受蔗糖含量的增加影响大，浓度高的蔗糖溶液浓度的小的改变对核的沉淀速度会产生很大的影响，所以用蔗糖作梯度离心纯化细胞核需格外小心。甘露醇溶液用粘度没有蔗糖高，但同密度情况下，甘露醇溶液的渗透压要高于蔗糖溶液的，这也是需要注意的，以免核皱缩。Percoll是较好的介质，只是价格偏高。低速离心（500×g 左右），细胞核集中30%、35%的蔗糖界面较多。

6 存在主要问题及解决措施

植物细胞核提取遇到的主要问题有杂质多、核与内质网等粘连成网、容易破裂。杂质主要来自细胞壁、膜碎片和细胞质成分。过滤可以去除一些杂质，但严重降低核的收率，一方面网筛的大小不好选择，另一方面导致细胞核破裂，特别是使用抽滤。图1告诉我们植物细胞核膜连着一些网状的细胞成分，筛孔小了，它过不去，筛孔大了，大的杂质就会多。如果将通过化学的方法将与膜连接的成分尽量去除，发现核又非常容易破损，即使是盖玻片轻轻的一压（见图2）。因此，对于与核膜连接的成分，既要去除，又要不能伤及核膜。减轻核与其它细胞成分粘连方法，可以考虑使用偏酸性的提取液、酶，不建议使用表面活性剂。低速离心甚至静止片刻（相当于1×g的离心）是较好的初步去除杂质的方法，精细去除杂质则需要进行梯度离心了。对于核容易破裂的问题，可以考虑使用一些膜的保护试剂，特别是在纯化的后期，比如葡聚糖硫酸钾、葡聚糖、蔗聚糖、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾等，同时注意提取纯化过程中溶液酸碱度的稳定，离心时尽量不使细胞核沉到离心管底部，而用蔗糖等溶液托住更好。

总之，植物细胞核的提取纯化目前还没有普遍适用的方法，探索适用不同植物、不同材料的核提取纯化方法还是需要研究的工作。

参考文献

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作者简介：王祥，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 2010级生物技术专业本科生。

*通讯作者：岳才军