发酵液中透明质酸提取纯化工艺的研究

摘要：本研究利用乙醇初步提取发酵液中透明质酸，确定最佳提取方案为乙醇体积分数60%，洗涤次数为两次。然后，以透明质酸含量为指标，在单因素试验的基础上，采用根据Box-Behnken原理设计的响应面法优化透明质酸纯化工艺。方差分析和交互作用分析表明，最佳纯化工艺为NaCl浓度45 g/L，温度55℃，pH值9.6，在此工艺条件下，透明质酸含量为93.71%。本工艺所生产的透明质酸纯度^高，符合化妆品、医药行业标准，具有广泛的应用价值。

关键词：透明质酸；发酵液；分离纯化；响应面

中图分类号：TS218文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）03-0134-06

AbstractIn this research， the hyaluronic acid was preliminarily extracted from fermentation broth using alcohol. The best extraction parameters were ethanol volume fraction of 60% and washing for two times. Using the content of hyaluronic acid as indicator， single-factor experiments were performed. Then the response surface analysis based on Box-Behnken experimental design was carried out to optimize the purification process of hyaluronic acid. Through analysis of variance and interaction， the optimal purification process was NaCl additive amount of 45 g/L， temperature of 55℃ and pH value of 9.6. Under the optimized conditions， the actual content of hyaluronic acid reached up to 93.71%. By this process， the content of hyaluronic acid was higher， which conformed to the stands of cosmetic and pharmaceutical industries， so it had extensive application value.

KeywordsHyaluronic acid； Fermentation broth； Separation and purification； Response surface

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种高分子量的酸性黏多糖，由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3糖苷键反复交替连接而成[1]，由于其独特的流变学特性、黏弹性、保湿性以及良好的生物相容性，透明质酸在化妆品、医学领域都有广泛的应用[2]。透明质酸用于食品领域还处于起步阶段。近年来国内外关于HA口服后吸收、代谢和功效的研究越来越多，大量科学证据证明了其功效。特别是2008年5月，国家卫生部按照《新资源食品管理办法》的规定相关公告，批准透明质酸钠作为一种新资源食品用于保健食品原料。这一公告的必将进一步推动HA在我国保健食品中的应用。

微生物发酵法是目前透明质酸的主要生产方式，而下游分离纯化工艺是获得高纯度HA的关键环节，也是制约多数企业生产高标准透明质酸的瓶颈。根据透明质酸国家质量标准和行业标准，成品中热源蛋白质含量越低，透明质酸含量越高，产品质量越高。因此，除去发酵液中的热源蛋白是透明质酸分离纯化的首要任务。

依据文献，从发酵液中分离提纯透明质酸主要有大量稀释膜滤法、季铵盐法、氯仿法、酶法、离子交换层析等[3-5]，这些方法存在生产成本高、操作复杂、纯度和回收率低、环境不友好等诸多缺点，不利于在工业中应用。本研究利用乙醇对发酵液中透明质酸进行初步粗提，之后采用响应面法优化纯化工艺，得到了纯度和产率都较高的透明质酸，并在山东某透明质酸生产工厂得到应用，具有较大的实际生产参考价值。

1材料与方法

1.1材料与仪器

透明质酸发酵液：山东某透明质酸生产公司提供；β-葡萄糖醛酸：购自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）：购自北京欣经科生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯；水为二次去离子水。

UV-1910型紫外-可见分光光度计（北京普析），D2F-6090真空烘箱（上海精宏实验设备有限公司），LXJ-ⅡB 低速大容量离心机（上海精密仪器仪表有限公司），79480型真空冷冻干燥机（Labconco 公司），ALC-1100型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1工艺流程透明质酸发酵液乙醇粗提洗涤溶解纯化过滤调整pH值95%乙醇沉淀真空冷冻干燥成品。

1.2.2透明质酸粗提①粗提乙醇体积分数的选择：在快速搅拌下，分别向1 000 mL新鲜HA发酵液中加入95%的乙醇，使混合液中乙醇终体积分别控制在30%、40%、50%、60%、70%。加入过程需缓慢，避免大结块沉淀产生。加入完毕后快速搅拌10 min，静置1 h后置于1 000 r/min离心机中离心5 min。取沉淀，测HA含量，考察添加不同体积乙醇对于HA提取量的影响。②洗涤次数的确定：取离心后沉淀，加入300 mL 95%乙醇进行洗涤，洗涤次数分别为1、2、3次。考察洗涤次数对于溶液透光率、HA提取量的影响。③透明质酸溶解方案的确定：取洗涤后沉淀，加入1 500～4 000 mL去离子水进行溶解。以溶解后粘度作为确定溶解相应方案的指标。

1.2.3HA纯化单因素及响应面试验设计首先以NaCl添加量、溶解温度、pH值进行影响成品中HA含量的单因素试验，之后考虑反应时间对HA纯化效果的影响，确定最佳反应时间。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken进行纯化工艺的优化设计。

1.2.4HA纯化液处理方法向优化完毕的纯化液中加入质量比为1%的珍珠岩助滤剂，搅拌均匀，通过板框过滤除去沉淀杂质，滤布型号750b，过滤压力低于0.4 MPa。过滤完毕后，乙酸调整pH值7.0，使用1.5倍体积95%乙醇雾状喷入滤液中，不断搅拌，使HA在搅拌中聚集成颗粒沉淀。收集颗粒状沉淀透明质酸，使用95%乙醇脱水3次后，放入真空冷冻干燥机冻干即得产品。

1.3指标检测方法

透明质酸含量测定：采用咔唑法[6]，以葡萄糖醛酸为标准品。蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法[7]，以牛血清白蛋白为标准品。测定HA的平均相对分子质量用黏度法[8]，参比液为0.2 mol/L的NaCl溶液，测定温度为（25±0.05）℃，采用3点法外推，求出特性粘度[η]，并根据公式[η]=3.6×10-4Mr0.78计算出平均相对分子量（Da）。溶液透光率的测定[9]：以纯水的透光率为100%，测定样品在550 nm处的透光度T值。

2结果与分析

2.1透明质酸粗提

2.1.1粗提乙醇体积分数的选择透明质酸不溶于有机溶剂，由于乙醇沉析作用强、挥发性适中、无毒、可回收性强，故在工业或者研究中，常用乙醇作为透明质酸的初步提取剂。由图1可以看出，随着乙醇体积的增加，透明质酸提取量逐渐增加，但乙醇体积为70%时与60%时相比，透明质酸的提取量几乎没有变化，综合考虑成本，选择乙醇体积为60%最佳。

2.1.2洗涤次数的选择依据诸多文献与资料，HA粗品中杂质含量越少，透光率越高。由图2可以看出，洗涤次数增加，透明质酸含量变化不大，透光率逐次增大，且洗涤2次后，透光率显著增大，这是由于乙醇具有脱色功能，会脱去发酵液中自有的一部分颜色，特别是对于染菌发酵液、培养液灭菌温度过高等异常发酵液效果更为明显；同时，HA粗提沉淀物中会有一大部分醇溶性杂质溶解于洗涤用乙醇溶液，故透光率会逐次增加。另一方面洗涤后杂质的减少也更利于后面纯化工艺的有效进行。考虑到生产成本、生产周期以及洗涤效果选择洗涤2次作为最佳选择。

2.1.3透明质酸溶解方案的确定HA粗沉淀溶解后粘度的大小会显著影响过滤的速度和时间，继而影响透明质酸的分子量和回收率，故溶解体积的选择主要是依据溶解后溶液的粘度来确定。粘度的大小主要受透明质酸发酵液中透明质酸产量和分子量的影响，透明质酸产量和分子量越大，粘度越高；同时透明质酸溶液是非牛顿型流体，分子量的增大会使溶液的粘度非线性显著性增强。由于每次发酵透明质酸生产水平和分子量不同，确定一个固定的最佳溶解体积是不现实的，故选择溶解液粘度作为最终溶解体积的判断标准。经过多次实验室和中试试验，综合考虑生产成本、周期、操作难易等因素，确定溶解后温度在50℃左右、粘度在2 000～3 500 mL/g之间为最佳。

2.2HA纯化单因素试验

2.2.1NaCl添加量对HA含量的影响溶解温度50℃、pH值9.0条件下，控制NaCl添加量20～60 g/L之间，考察NaCl添加量对HA含量的影响，结果如图3所示。

水溶液中蛋白质的溶解度一般在一定离子强度范围内最大，低于或者高于此范围时溶解度均下降。依据诸多文献，盐析法是去除酸性多糖中蛋白质最常用的方法。从图3可以看出，NaCl浓度对于HA纯化影响显著，在低浓度下，溶解液中蛋白质溶解度较大，HA含量较低；随着NaCl浓度增大，HA含量逐渐升高，当NaCl添加量达到40 g/L时，HA含量几乎达到最大；继续增大NaCl添加量，效果并不显著，故NaCl添加量确定为40 g/L。

2.2.2温度对HA含量的影响NaCl添加量40 g/L、pH值 9.0条件下，控制溶解温度40～60℃之间，考察溶解温度对 HA含量的影响，结果如图4所示。

蛋白质溶解度一般随着温度升高而增大，但是在高离子强度情况下，大部分蛋白质的溶解度随着温度的升高而逐渐降低。从图4可以看出，随着温度的升高，HA含量逐次急剧升高，当温度达到50℃时，透明质酸含量最大，这是由于温度的升高使绝大多数蛋白质聚集沉淀的结果，与参考文献[10]的报道相吻合。当溶解温度大于50℃时，HA含量逐渐下降，可能是由于其他杂质以及极少部分蛋白质的溶解度随着温度的升高而升高，导致HA含量下降。因此选择溶解温度为50℃时最佳。

2.2.3pH值对HA含量的影响NaCl添加量40 g/L、溶解温度50℃条件下，控制pH值8.5～10.5之间，考察pH值对HA含量的影响，结果如图5所示。

等电点沉淀也是多糖去除蛋白常用的方法之一。从图5可以看出，pH值为9.5时含量最大，低于或者高于9.5时，HA含量都会降低，说明HA发酵液中蛋白质等电点在9.5左右分布较多。故纯化时pH值控制在9.5左右最佳。

2.2.4反应时间对HA纯化效果的影响NaCl添加量40 g/L、pH值9.5条件下，控制溶解温度50℃，考察不同反应时间对HA分子量及含量的影响。

从图6可以看出，随着反应时间延长，HA含量逐u上升，在反应时间达到2 h时，透明质酸含量几乎达到了最大，主要原因在于蛋白质受盐析、等电点、升温等协同作用，逐渐沉淀下来，在过滤中被加速除去的结果；另一方面，随着反应时间的延长，HA分子量逐渐下降，这是由于透明质酸多糖链的降解主要是由水解和羟基上的活性氧引起的，而pH值的升高会影响羟基自由基的产生从而加速HA的降解[11-13]。综合考虑，在保证HA高含量提取的情况下，应当尽量缩短反应时间，减少HA降解。反应时间确定为2 h最好。

2.3响应面优化HA纯化试验

2.3.1响应面分析方案及试验结果在单因素试验基础上，固定溶解反应时间2 h，参考NaCl添加量、溶解温度、pH值3个因素对HA含量的影响，并用响应面法进行优化，以HA含量作为响应值，根据响应面法中的Box-Behnken试验原理运用Design Expert 8.0进行设计。响应面分析因素与水平见表1，试验设计与结果见表2。

2.3.2模型的建立及其显著性检验利用Design-Expert 8.0软件对表2试验数据进行二次多项式逐步回归拟合，得回归模型方程为：

Y=93.24+3.25A+0.22B+0.28C+0.45AB-0.13AC-0.17BC-3.76A2-1.3B2-2.47C2

模型的可靠性可以从方差分析及相关系数来考察，见表3。结果表明，所得的回归方程极显著（P0.05，不显著，因此二次模型成立，应用此方程可以预测透明质酸含量及纯化工艺。从对透明质酸含量影响来看，一次项A，二次项A2、B2、C2，交互项AB影响极显著；一次项B、C影响显著；交互项AC、BC影响不显著，说明各个具体试验因素与响应值都不是简单的线性关系。透明质酸含量影响因素大小排序为A（NaCl）> C（pH值）> B（温度）。

2.3.3响应面分析透明质酸纯化工艺中NaCl添加量、溶解温度、pH值3个因素之间的交互作用对HA含量的影响如图7所示。

由图7a可以看出，NaCl浓度和温度的交互作用明显，维持NaCl浓度在较高水平时，增大温度对于提高HA含量效果显著，但温度过高时，HA含量也会随温度的继续升高而逐渐下降，因此，在纯化工艺中，维持高NaCl浓度，适当提高温度有利于HA含量的增加。由图7b可以看出，在较高的NaCl浓度条件下，维持溶解pH值在9.5左右时，HA含量可以达到最大值。由图7c可以看出， HA含量随温度和pH值升高而逐渐增大，但达到一定值之后，HA含量出现下降的趋势，控制好温度和pH值的影响对HA纯化有重要指导意义。

2.4最佳工艺参数确定及验证性试验

通过对模型方差分析得出最佳的工艺参数为：NaCl浓度为45.48 g/L，温度为54.46℃，pH值9.6时，HA含量可以达到93.77%。为检验响应面法优化发酵液中HA纯化工艺的可靠性，采用优化后的工艺条件进行验证试验，参考实际操作将优化后的工艺参数调整为NaCl浓度为45 g/L，温度为55℃，pH值9.6。在此条件下，HA含量为93.71%，与模型预测值基本相符，说明试验具有实际应用价值。

2.5产品性状

利用上述工艺条件及纯化液处理，即得透明质酸成品，颜色为白色，无不良气味，易吸湿。经化验，透明质酸含量达到93.71%，蛋白质含量为0.025%，透光率为99.8%，产品指标达到食品级和化妆品级透明质酸质量标准。对成品HA溶液进行紫外图谱扫描，扫描波长为190～400 nm，HA浓度为0.5 g/L。结果表明，成品仅在198 nm处有一个多糖吸收峰，在280 nm和260 nm处几乎没有吸收峰存在，表明HA成品中蛋白质和核酸等杂质含量极少[14]。

3结论

利用乙醇初步提取发酵液中透明质酸，确定了最佳粗提工艺为乙醇体积分数为60%，洗涤次数为2次。通过单因素试验和响应面设计，得出影响HA含量的工艺因素按主次顺序为NaCl添加量>pH值>溶解温度，最佳纯化条件是NaCl浓度为45 g/L，温度为55℃，pH值9.6。在此最佳条件下，HA含量达到93.71%，蛋白质含量为0.025%，透光率为99.8%，产品指标达到食品级和化妆品级透明质酸质量标准要求。

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