酸奶发酵过程中游离氨基酸含量的分析

摘要：酸奶的氨基酸含量与其营养价值、风味及质构密切相关。试验研究了酸奶发酵过程中各种游离氨基酸含量的变化。结果表明，在40 ℃恒温发酵10 h的过程中，酸奶的总游离氨基酸含量先降后升，发酵0～8 h以乳酸菌分解游离氨基酸占主导地位，8～10 h以蛋白质水解占主导地位。谷氨酸、组氨酸、蛋氨酸、两种芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）和支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）含量在整个发酵过程中呈现持续下降趋势且在0～4 h时下降幅度为极显著；而牛磺酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸和赖氨酸含量在4～8 h时下降幅度为极显著；而精氨酸和天冬氨酸含量在整个发酵期间呈现持续上升的趋势。另外通过主成分分析发现40 ℃发酵10 h酸奶游离氨基酸水平进入相对稳定的阶段，结合pH检测及感官评定，选择10 h作为其发酵终点。

关键词：酸奶；发酵；乳酸菌；游离氨基酸

中图分类号：TS252.41 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3137-04

Change of Free Amino Acids in Fermentation of Yoghourt

WANG Quan-lia，HE Si-yunb，HE Xi-yaob，ZOU Zhia

（a. Dean′s Office； b. College of Culinary and Food Technology， Wuhan Business University， Wuhan 430056， China）

Abstract： The amino acids in yoghourt closely related with the nutrition， flavor and texture were analyzed during yoghourt fermentation process. The resuls showed that the contents of total free amino acids first decreased and then increased during the 10 h fermentation under 40 ℃. During the fermentation from 0 to 8 hours， the catabolism reaction by lactic acid bacteria played a dominant role while during the 8 h to 10 h the total free amino acids increased mainly because the hydroxylation of casein and polypeptide. The contents of glutamate， histamine， methionine， two kinds of aromatic amino acid and branched-chain amino acids continuously decreased especially during 0 to 4 hours while the contents of taurine， alanine， glycine， threonine， serine and lysine reduced sharply during 4 to 8 hours. The level of arginine and asparate continuously increased in the process. Results of the principal component analysis showed that the contents of free amino acids in yoghourt reached relatively stable level when it was fermented under 40 ℃ after 10 hours taken as the end of fermentation by pH test and sensory evaluation.

Key words： yoghourt； fermention；lactic acid bacteria； free amino acids

酸奶是以乳和乳制品为原料，通过添加发酵剂产生大量乳酸的一种发酵乳制品。酸奶发酵剂一般为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），人们常将它们称之为乳酸菌（lactic acid bacteria）[1，2]。经过乳酸菌的发酵，牛奶中大量的酪蛋白和乳清蛋白转化为更易吸收的多肽和氨基酸。酸奶中氨基酸不仅有益肠道健康[3]，可提高机体免疫功能[2]，还能通过转氨酶的作用形成α酮酸类物质，进一步转化为醛、醇和酯类风味物质[4]；此外酸性氨基酸可影响酸奶pH，有助于凝胶结构的形成[5]。总之酸奶中氨基酸的含量与酸奶的营养、风味和质构特点密切相关。目前关于酸奶制作过程中氨基酸含量变化的报道尚不多见[6]。本试验采用氨基酸分析仪动态分析了酸奶发酵过程中游离氨基酸含量的变化，旨在为进一步研究酸奶的营养保健价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

光明优倍高品质鲜牛奶（蛋白质含量约3.4 g/100 mL），伊仕特酸奶发酵剂（包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊仕乳杆菌），白砂糖，均为食品级。

1.2 仪器

小熊酸奶机、酸度计、氨基酸自动分析仪（L-8800型）。

1.3 方法

1.3.1 酸奶制作工艺及操作要点 在室温条件下，取鲜奶1 L，加入1 g酸奶发酵剂和65 g白砂糖，充分混合均匀。将混合物放入酸奶机内，（40±1） ℃恒温发酵12 h。发酵过程均为密闭条件，且采用温度计监控发酵温度。

1.3.2 取样与保存 从牛奶混合物温度达40 ℃时开机计时，分别在试验0、1、2、4、6、8、10、12 h时取样，样品置于冰水混合物中，降温后0 ℃冻存。每个样品设3个平行。

1.3.3 样品分析 每个样品使用pH计检测其pH，作为其发酵程度的控制标准。样品中游离氨基酸分析参照GB/T5009 124-2003《食品中氨基酸的测定》进行。

1.3.4 统计分析 应用SIMCA-P对酸奶发酵过程中不同时间点的氨基酸含量进行主成分分析。应用EXCEL和SPSS16.0统计软件对试验数据进行统计分析。氨基酸含量以平均值±标准差表示，数据显著性分析采用t检验或非参数检验。

2 结果与分析

2.1 酸奶制作过程中pH的变化

在酸奶40 ℃恒温发酵过程中，酸奶pH随时间变化的趋势如图1所示。由图1可见，在酸奶发酵初期（0～2 h），其pH变化趋势较为缓和，原因可能在于此时各种菌株尚未充分活化，发酵过程处于初始阶段，并且牛奶中天然包含的缓冲体系也发挥了一定作用。在发酵4～8 h时，后一个时间点与前一个时间点的pH具有显著的统计学差异，pH由6.3下降为5.7。而在发酵后期（10～12 h），酸奶pH变化再次趋缓。在白砂糖含量为65 g/L的条件下，结合感官评定后认为发酵10 h时酸度较为合适，而12 h时酸度略微强烈。考虑到酸奶发酵后4 ℃储存时发生的后发酵过程，为避免酸奶过酸，最终选择发酵10 h 作为试验终点。

酸奶在发酵过程中口感变酸、pH下降主要是由于乳酸菌代谢乳糖生成乳酸所致。乳糖在β-半乳糖糖苷酶的作用下分解为半乳糖和葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径产生乳酸，此过程中己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是其限速酶。此外乳酸菌在发酵过程中产生的甲酸及各种酸性氨基酸对酸奶pH的下降也有部分影响。

2.2 酸奶制作过程中氨基酸含量的主成分分析

主成分分析法是采用数据降维的方法，将多维矩阵数据重新组合成一组新的相互无关的几个综合变量，同时根据方差大小抽取综合变量，尽可能多地保持原来变量信息的统计方法。在主成分分析的得分图（图2）中，可见试验0 h的3个样本和试验4 h的样本距离较远，表明试验0 h和4 h的各种氨基酸含量总体差别较大；而试验8 h和10 h的样本分布集中，即试验8 h和10 h时酸奶氨基酸总体变化较小。这表明试验8～10 h，发酵酸奶的氨基酸含量进入一个相对稳定的水平。

2.3 酸奶制作过程中氨基酸含量的变化

蛋白质水解生成为多肽，再将多肽转化为游离氨基酸加以利用，这是乳酸菌最重要的代谢活动之一。目前至少16种由乳酸菌产生的多肽已经被确认[1]。许多游离氨基酸的代谢也已被阐明。然而还有一些氨基酸及多肽的代谢有待进一步研究。本试验中（图3）总游离氨基酸（TFAA）含量在0～8 h持续下降，而在8～10 h含量略有上升，这表明在40 ℃恒温发酵的过程中，蛋白质水解成游离氨基酸的过程和乳酸菌进一步分解利用游离氨基酸的过程同时存在，且0～8 h时乳酸菌的分解占主导地位，之后蛋白质水解占主导地位。必需游离氨基酸（EFAA）随发酵时间的延长呈现持续降低的趋势。

在发酵开始（0 h）时，牛奶游离氨基酸中牛磺酸含量最高，达到了16.7 g/L（图4 C），其次是谷氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。不同动物的母乳中其游离氨基酸的组成模式并不完全相同，可能与小动物哺乳期的不同营养需求相关。一般而言，牛磺酸是小鼠、猫、狗和猴子母乳中含量最多的氨基酸，但是对兔、牛、马而言，牛磺酸含量并不是很高[7]。本试验牛奶中含量最高的牛磺酸来源尚不清楚。另外牛奶中氨基酸的含量还与奶牛的生理状况密切相关，一般认为在泌乳期29 d之后，谷氨酸及谷氨酸盐成为牛奶中含量最为丰富的氨基酸[7]。在本试验中发现牛奶游离氨基酸中几乎不含有精氨酸，只含有少量的鸟氨酸和色氨酸。

由图4 A、图4 B可见，随发酵时间的延长，谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和组氨酸含量总体呈现下降趋势，且在0～4 h时氨基酸含量下降最为迅速。其中谷氨酸在乳酸菌脱羧酶的作用下可生成γ-氨基丁酸，试验4～8 h时，谷氨酸含量下降而γ-氨基丁酸呈现上升趋势，这表明试验4～8 h时谷氨酸的分解反应可能被激活。芳香族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸含量在整个发酵过程中持续下降，文献[4]表明其在氨基转移酶的作用下分解，产生的代谢物具有花香，与酸奶风味密切相关。同为芳香族氨基酸的色氨酸在试验4～8 h含量显著升高，其原因有待进一步研究。支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）含量也随发酵时间的延长而持续降低，其原因很可能是其通过氨基转移酶代谢为酮酸类物质，最终转化为醛、醇及脂肪酸类物质，可以产生麦芽、水果及甜香味[4]。

由图4C、图4D可见，牛磺酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸及赖氨酸含量在0～4 h时或者下降或者上升，但是在4～8 h时下降极为显著，之后（8～10 h）除丙氨酸含量略有上升和丝氨酸含量下降外，其他氨基酸含量基本维持稳定。

由图4 E可见，精氨酸和天冬氨酸含量随发酵时间的延长持续升高，这表明蛋白多肽水解产生精氨酸和天冬氨酸的分解过程占主导地位。精氨酸还可以在精氨酸脱亚氨（Argininedeiminase，ADI）的作用下转化为瓜氨酸，进一步分解为鸟氨酸，且通过底物水平磷酸化供能并释放出游离氨。而鸟氨酸含量降低，表明精氨酸的分解代谢受到抑制。同样地，天冬氨酸在脱羧酶的作用下可转化为丙氨酸。丙氨酸含量降低表明天冬氨酸的分解受到抑制。但是由于精氨酸和瓜氨酸及天冬氨酸和丙氨酸的变化趋势并非完全相反，表明瓜氨酸和丙氨酸还有其他的代谢途径。

由图4 F可见，γ-氨基丁酸、半胱氨酸、鸟氨酸和色氨酸含量在发酵0～4 h时显著下降，在4～8 h时显著上升，在8～10 h时含量又显著下降。其含量变化的原因有待进一步研究。

3 结论

在发酵的过程中，游离氨基酸含量的变化是蛋白质水解与乳酸菌分解氨基酸代谢的综合结果。在40 ℃持续发酵10 h的过程中，总游离氨基酸含量先降后升，试验0～8 h以乳酸菌分解游离氨基酸占主导地位，8～10 h以蛋白质水解占主导地位。谷氨酸、组氨酸、蛋氨酸、两种芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）和支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）含量在整个发酵过程中呈现下降趋势且在0～4 h时其含量均极显著下降；牛磺酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸和赖氨酸含量在4～8 h时极显著下降；精氨酸和天冬氨酸含量在整个发酵期间呈现持续上升的趋势。另外通过主成分分析，酸奶经40 ℃发酵后10 h，其氨基酸水平进入相对稳定的阶段。

参考文献：

[1] CHRISTENSEN J E，DUDLEY E G，PEDERSON J A， et al. Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，1999，76（1-4）：217-246.

[2] MEYDANI S N， HA W K.Immunologic effects of yogurt[J]. The American Journal of Clinical Nutrition，2000，71（4）：861-872.

[3] ADOLFSSON O， MEYDANI S N，RUSSELL R M. Yogurt and gut function[J]. The American Journal of Clinical Nutrition， 2004，80（2）：245-256.

[4] ARD？ Y. Flavour formation by amino acid catabolism[J]. Biotechnology Advances，2006，24（2）：238-242.

[5] 马 嵬，金素钰，郑玉才.酸奶中游离氨基酸含量及乳清蛋白组成分析[J].中国乳品工业，2006，34（6）：20-22.

[6] 郑坚强，司俊玲，纵 伟，等.超高压处理对生鲜牛乳中氨基酸和微生物的影响[J].湖北农业科学，2011，50（10）：2114-2116.

[7] RASSIN D K，STURMAN J A，GAULL G E.Taurine and other free amino acids in milk of man and other mammals[J]. Early Human Development，1978，2（1）：1-13.