中介素1-53对急性肺损伤大鼠SP-A及IL-18的影响

[摘要] 目的 探讨脂多糖致急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液（BALF）中表面蛋A（pulmonary surfactant associated protein A，SP-A）浓度及肺组织单核巨噬细胞中白介素18（interleukin 18，IL-18）的表达水平及中介素1-53（intermedin1-53，IMD1-53）的影响。 方法 将36只雄性Vistar大鼠随机分为正常组（A组）、急性肺损伤组（B组）、中介素1-53干预组（C组），于2 h，4 h分别测定血气分析，后处死大鼠，测定肺组织湿/干比（W/D）、ELISA法检测BALF中SP-A的浓度、免疫组化法检测肺单核巨噬细胞内IL-18表达及各时间点肺组织病理变化。 结果 与A组比较，B组动脉血PO2和BALF中SP-A浓度降低显著（P < 0.05），湿干比及单核巨噬细胞中IL-18表达增加（P < 0.05），肺组织充血水肿明显。与C组相比，上述改变得以逆转，肺损伤程度明显减轻（P < 0.05）。 结论 中介素1-53可通过抑制SP-A的减少和IL-18的生成在急性肺损伤早期起到一定的保护作用。

[关键词] 急性肺损伤；中介素1-53；SP-A；IL-18

[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2012）03-0001-03

Effects of intermedin 1-53 on SP-A and IL-18 in LPS-induced acute lung injury septic rats

LIU Ling1 LI Jianqiang2 SHI Jing1 ZHAO Hui2

1.Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Department of Respiration, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

[Abstract] Objective To explore the influence of intermedin1-53 on the leve of SP-A in BALF and IL-18 expressions of alveolar macrophages in lipopolysaccharide of LPS-induced acute lung injury (ALI) in rats. Methods All of 36 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: normal control (A), LPS-treated group (B), intermediary 1-53 intervention group (C). Blood samp leswere taken for blood gas analysis at 2, 4 h.The animals were killed after 4 h, the ratio of wet to dry lung weight was measured. The concentration of SP-A in BALF with ELISA method. The exression of IL-18 was examined by immunohistochemical method and the changes of lung tissue were pathol ogically observed. Results Compared with group A, PO2 and SP-A had a decreased significantly in 2 and 4 hours in group B (P < 0.05）. The ratio of wet to dry lung weight and the expressi of IL-18 alveolar macrophages in lipopolysaccharide had a increased significantly in group B (P < 0.05), The degree of lung injury was hardly. These changes were inverted in group C, and the degree of lung injury was markedly at tenuated (P < 0.05). Conclusion The intermediary 1-53 through inhibide the decreased of SP-A and expression of in the early stage of acute lung injury has a protactive function.

[Key words] Acute lung injury (ALI); Intermedin1-53 (IMD1-53); Pulmonary surfactant protein A (SP-A); Interleukin-18(IL-18)

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是各种直接或间接致伤因素导致的急性低氧性呼吸功能不全，临床上主要表现为难以纠正的低氧血症及进行性加重的呼吸困难。ALI是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的早期阶段。二者本质来源于过度炎症反应所致肺内皮细胞和肺上皮细胞的广泛损伤[1-2]，各种炎性因子的释放及肺表面活性物质的缺乏使ALI的生理过程成为一个恶性循环，只有在疾病早期有效地控制 ALI的发展进程，才能遏制 ARDS的产生和发展。中介素（IMD）是2004年Roh[3]等用种系特征方法分析基因库，从人类和其他脊椎动物基因组证实的一种新的降钙素（CT）/降钙素基因相关肽（CGRP）家族。IMD前体蛋白可被内源性肽酶降解为prepro-IMD95-147即IMD1-53，目前国内外有报道IMD1-53对油酸致急性肺损伤、心肌缺血再灌注损伤、肾脏缺血再灌注损伤及肺缺血再灌注损伤均有保护作用，但其保护作用主要集中在抗氧化方面[4-7]，与SP-A及IL-18相关联的研究目前尚无报道。本实验通过检测不同处理条件下BALF中SP-A及肺单核巨噬细胞胞浆中IL-18的表达水平，了解IMD1-53在急性肺损伤早期所发挥的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组和处理

8周龄健康雄性Wistar大鼠（山西医科大学实验动物中心提供）36只，体重（200±20）g，随机分为正常组、急性肺损伤组、中介素1-53干预组，每组各12只。采用大鼠尾静脉注射脂多糖（LPS）5 mg/kg，制作大鼠急性肺损伤模型，正常组注入1 mL的生理盐水，而中介素1-53干预组在尾静脉注入脂多糖前1 h将2 nmol/kg中介素1-53溶于1 mL生理盐水注入腹腔，其他两组均注入1 mL的生理盐水。分别于2 h及4 h两个点采集标本。

1.2试剂

IMD1-53粉剂：美国phoenix公司；脂多糖：美国sigma公司；兔抗大鼠IL-18多克隆抗体：北京博奥森生物公司；SP-AELISA试剂盒：上海地泽生物公司。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 PaO2测定 留取腹主动脉血通过全自动血气分析仪进行检测。

1.3.2 肺 W/ D比值测定 正常组、急性肺损伤组和IMD1-53干预组动物做肺组织 W/ D比值测定。动物麻醉放血处死后开胸，游离双肺，结扎并剪下右肺，称取右肺中下肺叶湿重，后置55℃烤箱干燥，48 h后取出，称取干重，计算肺 W/D比值。

1.3.3 BALF中SP-A浓度测定 动物麻醉放血处死后开胸，游离双肺及主支气管，在气管分叉处结扎右肺，用4℃生理盐水5 mL灌洗左肺，反复抽吸7～8次，后取灌洗液3 mL移至离心管中，4℃下经 3000 r/min离心 10 min，留取取上清液备用，采用 ELISA方法测定 BALF中SP-A浓度。

1.3.4 病理检查 取右肺上叶组织块，用10％甲醛同定，予以常规石蜡包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.3.5 免疫组化方法测肺单核巨噬细胞中IL-18的表达 将上述组织蜡块连续切片采用体积分数为3%过氧化氢封闭，微波炉抗原热修复，滴加一抗（兔抗大鼠IL-18多克隆抗体）及相应二抗工作液，滴加辣根过氧化物酶工作液，DAB显色，脱水，透明，封片。阳性表达为细胞浆内棕黄色颗粒。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统处理，分别测每视野的阳性表达的吸光度。

1.4 数据处理

所有实验数据用均数±标准差表示，用SPSS 19.0软件进行多组资料方差分析，各时点组间多重比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PaO2变化

在脂多糖诱发ALI后（B组）2 h，4 h点PaO2显著低于正常对照组（P ＜ 0.01），予IMD1-53干预后各时相 PaO2均显著升高（P ＜ 0.01）。见表1。

2.2 大鼠肺 W/D变化

B组各时间点肺 W/D比值显著高于A组（P < 0.01）。IMD1-53干预后则比值减小（P < 0.05或P < 0.01），C组各时间点均值均较A组高，2 h点相比差异有统计学意义（P < 0.01），而4 h点差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 组织病理学变化

B组大体标本可见肺组织肿胀，散在出血点；光镜下观察见肺泡间隔明显增宽，肺泡壁完整性破坏，肺组织大量炎症细胞浸润，肺泡腔红细胞及单核巨噬细胞渗出，局部透明膜形成，伴局灶性肺不张和肺气肿。随病程的延长，病变程度逐步加重，C组各时相组病变程度均较B组各相应时相组减轻。见图1～2。

2.4 BALF中SP-A浓度的变化

与A组各时间点相比，B组BALF中SP-A浓度下降明显（P < 0.01），C组与B组各时间点相比，SP-A浓度明显增高（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

2.5 肺泡巨噬细胞胞浆IL18的表达变化

免疫组化结果示：B组各时间点测得肺单核巨噬细胞中IL-18吸光度A组明显升高（P < 0.05或P < 0.01），IMD1-53干预后，C组IL-18吸光度下降显著（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

3 讨论

本研究采用尾静脉注射脂多糖诱发ALI的模型，动物致伤后，病理显示，肺组织结构受损，大量炎症细胞浸润，肺 W/D比值增加，PaO2进行性下降，BALF中SP-A浓度逐渐减少，肺单核巨噬细胞合成IL-18明显增加，均提示 ALI的存在，且随致病时间的延长，损伤呈逐步加重的趋势。运用外源性IMD1-53对其进行干预处理后，大鼠急性肺损伤程度明显减轻，与急性肺损伤组比较差异有统计学意义，提示IMD1-53在急性肺损伤早期可发挥保护作用。

SP-A是由肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ）合成、分泌的，对于维持肺泡的正常结构与功能起着重要作用。肖燕等[8]证实BALF中SP-A 的含量在ALI后1 h 就出现明显降低，并在6h内维持较低水平。有实验证实在BALF 中 ALI患者比正常低50%～70%[9]，其原因可能是由于肺损伤引起 Ⅱ型上皮细胞肿胀、脱落，大量炎症细胞侵入，释放大量氧自由基、细胞因子及蛋白水解酶，破坏增加，生成减少，从而造成 SP-A 含量降低[10-11]。同时由于肺泡毛细血管膜通透性增高，造成血管内大分子和 PS的双向渗漏，导致 SP-A降解增加[12]。生成减少和丢失严重是造成急性肺损伤BALF中SP-A浓度显著减少的主要原因。Lin和Ware等[13-14]认为SP-A可作为反映ALI/ARDS后Ⅱ型细胞功能的早期指标，也是判断患者肺损伤程度和预后的指标。本实验BALF中SP-A浓度变化与上述实验结果相符，同时IMD1-53干预后SP-A浓度升高明显，说明IMD1-53在急性肺损伤早期可通过抑制SP-A的减少发挥保护作用，但具体机制到目前仍不十分明确，可作为我们今后研究的新方向。

IL-18 是新近发现的一种炎性细胞因子，属于IL-1β超家族，IL-1的特征样结构主要由活化的肺脏单核巨噬细胞产生。IL-18可以诱导炎症早期细胞因子的产生，如TNF-α、IL-1β等，这些细胞因子进一步促进下游的细胞因子产生，如IL-8、巨噬细胞炎性蛋白 -1α（MIP-1α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等[15]。IL-18和多种炎性因子造成的炎症瀑布效应导致ALI的发生和发展[16]。近期研究亦表明，ARDS 患者的死亡率与患者IL-18水平呈正相关[17]。本实验结果显示，急性肺损伤后肺单核巨噬细胞中IL-18合成增加，说明IL-18在ALI的早期参与损伤机制。而应用IMD1-53进行干预后，其合成水平较损伤时间点明显下降，且组织病理损伤程度减轻，说明IMD1-53在ALI早期即可发挥较强的抗炎作用，是遏制ALI发生和发展的一个治疗手段。

IMD1-53是一种新型生物制剂，其对很多器官的缺血再灌损伤及急性肺损伤都有保护作用，本实验验证了IMD1-53对急性肺损伤的保护作用，但IMD1-53目前还未应用于临床，但其给我们临床治疗及药物的开发指明了新的方向。

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（收稿日期：2011-12-02）