葡萄酒菌类培育和发酵方法优化研究

本文作者：李涛 仲惟 单位：三门峡职业技术学院生化工程系

以葡萄作为原料经过发酵可生产出低度饮料酒即葡萄酒，葡萄酒中含有丰富的糖类、脂类及有机酸类物质，同时含有较多的维生素C，经过研究得出，葡萄酒中较高的超氧化物歧化酶具有延缓衰老，提高人体免疫力的功效，而且葡萄酒因其独特的葡萄果香，风味诱人，口感良好。正是由于其对人体健康有益，故最近广泛地受到消费者的喜爱。三门峡地处豫西边缘，居于豫、陕、晋三省接壤地带，地形地貌以山地、丘陵为主，每年葡萄产量丰富，单纯靠市场出售周期短且利润低，因此在本地区发展葡萄加工业具有非常重要的现实意义，一方面可改善原料浪费现状，另一方面又可提供一定数量的就业岗位，为地区经济发展做出一定的贡献。本研究一方面从本产区采集的葡萄果粒中分离到酵母株后，经过杜氏管发酵、酵母性能测定和模拟发酵，筛选出发酵性能优良的菌株，以提高产酒率；另一方面依托原有的葡萄酒生产工艺，选取优势菌株SY1作为试验菌株，通过改变葡萄汁起始糖度、酵母接种量及主发酵温度的单因素试验及三因素三水平的L9(33)正交试验，最终得出三门峡地区葡萄酒生产的最佳发酵条件。

1研究材料

1.1试验材料三门峡本地产赤霞珠葡萄、筛选到的优良酵母株1.2培养基1)液体富集用培养基：酵母膏0.05%，（NH4）2SO40.2%，葡萄糖5%，KH2PO40.25%，FeSO4•7H2O0.01%，MgSO4•7H2O0.1%，将上述培养基灭菌操作后加入Na2SO3至30mg/L。2)YEPD培养基：分离和保藏用。麦芽汁培养基：调节麦芽汁pH为4.75，糖度为12°Brix，然后在121℃条件下灭菌20min。3)发酵用培养基：酵母膏1%，(NH4)2SO40.1%，蔗糖20%，MgSO4•7H2O0.1%，KH2PO40.1%。

2仪器与设备

电子天平、打浆机、榨汁机、生物培养箱、高压灭菌锅、手持糖度计、温度计、酒精计等。

3研究方法

3.1菌种的筛选[1]采用酵母菌富集培养和分离，进行杜氏管发酵、酵母性能测定及后续模拟发酵筛选出优良菌株

3.2发酵工艺流程[2]葡萄分选洗涤去皮，去芯破碎、榨汁过滤，澄清成分调整主发酵换桶后发酵陈酿调配澄清后处理包装杀菌3.3工艺优化[3]采用单因素试验及L9(33)正交试验

4操作要点

4.1天然酵母的驯化培养及分离在本产区葡萄成熟季节，收集优良的葡萄果粒32份，将果皮取下，取样量为1.0g/份，破碎打浆后将其投入100mL灭菌过且添加了30mg/LNa2SO3的液体富集用培养基，保温25℃，摇床培养48h后进行分离操作。将上述富集培养液充分振荡后，取1mL投入100mL的生理盐水中，充分摇匀，使细胞分离，后用生理盐水继续稀释之数次，然后按照无菌操作要求将其涂布于培养皿上，保温25℃培养48h后，观察生长良好的单菌落，多次转接并继续分离纯化，经过此操作最终获得纯化菌株106株，然后将其转入试管保藏并备用。

4.2筛选优良酵母菌株

4.2.1发酵能力判断可根据酵母菌发酵糖类时产生CO2的量的多少来筛选出优良菌株。将分离后传代培养的酵母菌株转接到带有10°Brix杜氏管的麦芽汁培养基中，接种量为恒温培养48h后，选出产CO2较好的9株酵母。

4.2.2酵母菌的性能测定[4]采用CO2失重法测定发酵力的大小；以10min内酵母菌沉淀的容积值来判断酵母菌的凝聚力，沉淀容积为1.0mL以上者为强凝集性，发酵性能优良。酵母菌在糖液中发酵停止其最大的原因是由于酒精度升高所致，每一种酵母菌都有其耐受的最高酒精度；而在葡萄酒酿造中，为了保持原果汁的风味，通常不经杀菌，而是通过添加SO2来抑制杂菌保证发酵的正常进行，因此耐酒精及亚硫酸能力较强的酵母株即为优良葡萄酿酒酵母。分别在带有杜氏管的YEPD培养基中接入1.0×107个单位/mL的待测菌株后，再接入体积分数分别为8%，10%，12%，14%，16%，18%，20%的乙醇及50mg/L，100mg/L，200mg/L，250mg/L，300mg/L，350mg/L的SO2，将其于25℃条件下发酵培养3d，观察杜氏管中气泡产生情况，若气泡产生时间越早，产气量越大则发酵性能越好。经过上述性能测定筛选出两株发酵性能较好的酵母菌，分别命名为：SY1和SY2，并以此菌株进行模拟发酵进一步筛选试验菌株。

4.2.3模拟发酵筛选试验菌株将上述操作筛到的发酵性能优良的酵母菌株SY1和SY2分别以8%的量接入发酵用培养基中，在26℃条件下发酵生产葡萄酒，然后对所得产品的理化指标进行测定[4]并做出感官评价。进过检测，SY1和SY2模拟发酵所得葡萄酒酒精产率分别为13.6%和13.2%，相比普通酿酒酵母发酵产酒率分别提高3.3%和2.9%。还原糖残留量分别为2.8g/L和2.4g/L；72h内CO2的失重量分别为17.3g和18.5g，说明此两株酿酒酵母的发酵力较高。同时，结合感官评定结果，SY1发酵所产葡萄酒香气纯正、香味浓郁、酒质醇厚，故而作为后续的试验菌株。

4.3优化发酵工艺设计[5]4.3.1进行单因素试验

4.3.1.1筛选最适的葡萄汁起始糖度通过改变主发酵的葡萄汁起始糖度，分别在在葡萄汁糖度为16°Brix，18°Brix，20°Brix，22°Brix，24°Brix的条件下进行发酵生产葡萄酒，而发酵温度和酵母接种量为定值，分别为25℃和8%，发酵得到产品后对其进行酒精度等的品质指标检测，通过观察不同葡萄汁起始糖度条件下葡萄酒的品质指标变化趋势，筛选出最适的葡萄汁起始糖度。

4.3.1.2筛选最适酵母接种量通过改变主发酵的酵母接种量，分别在接种量为4%，6%，8%，10%，12%的条件下进行发酵生产葡萄酒，而葡萄汁起始糖度和发酵温度为定值，分别为22°Brix和25℃，发酵得到产品后对其进行酒精度等的品质指标检测，通过观察不同酵母接种量条件下葡萄酒的品质指标变化趋势，筛选出最适酵母接种量。

4.3.1.3筛选最适主发酵温度通过改变主发酵的温度条件，分别在20℃，22℃，24℃，26℃，28℃下进行发酵生产葡萄酒，而葡萄汁起始糖度和酵母接种量为定值，分别为22°Brix和8%，发酵得到产品后对其进行酒精度等的品质指标检测，通过观察不同温度下葡萄酒的品质指标变化趋势，筛选出最适发酵温度。

4.3.2优化发酵工艺过程单因素试验结果提供了最适的葡萄汁起始糖度、最适酵母接种量及最适主发酵温度区间，据此三因素可设计以酒精度和感官评价为试验指标的L9(33)正交试验[5]，最终得出最佳的发酵条件组合。

5结果与分析

5.1单因素试验结果

5.1.1最适葡萄汁起始糖度为保证葡萄酒的酒精含量及发酵的正常进行，需要在发酵之前对葡萄汁的起始糖度进行调整。从图1可以看到，当葡萄汁起始糖度为20°Brix，22°Brix，24°Brix时成品酒精度、可溶性固形物含量较高，但糖度较高时，残留还原糖的量稍有增加，说明发酵过程中对还原糖的利用率稍有下降，另外酸度也略有增加，结合感官评价，发酵产品的口感较佳，说明葡萄汁起始糖度选择20°Brix，22°Brix，24°Brix较佳。

5.1.2最适酵母接种量为保证葡萄酒的酒精含量及品质同样需要选择适宜的酵母接种量，接入较少的酵母菌，则发酵过程易被杂菌污染，而且发酵速率减慢；接入过多的酵母菌，则葡萄汁中的糖分大部分被酵母生长所利用，因此造成产品的酒精度降低，影响品质。从图2可以看到，酵母接种量为接种量6%，8%，10%时成品酒精度较高，残留还原糖较少且可溶性固形物含量较高，结合感官评价，发酵产品的口感较佳，说明酵母接种量选择6%，8%，10%时较佳。

5.1.3最适主发酵温度主发酵温度同样影响葡萄酒的品质及酒精度的高低，从图3可以看到，主发酵温度为24℃，26℃，28℃成品酒精度最高，酸度适中，残留还原糖含量较少且可溶性固形物含量较高，同时结合感官评价，成品酒口感较佳，说明主发酵温度选择24℃，26℃，28℃时较佳。

5.2L9(33)正交试验结果[6]根据上述单因素试验结果提供的最适的葡萄汁起始糖度、最适酵母接种量及最适主发酵温度区间，据此进行以酒精度和感官评价为试验指标的L9(33)正交试验[5]，试验结果见表1。由表1正交试验结果可知，以酒精度的高低作为发酵工艺评价指标时，较优的因素水平为A2，B3，C3，而影响酒精度高低的三因素主次顺序为C＞A＞B，较优的发酵条件组合为A2B3C3，此组合在试验中没有出现，故经过发酵证实，此组合所得成品酒酒精度较高为13.8%，感官评价得分为89.7，亦较高。以感官评价的高低作为发酵工艺评价指标时，较优的因素水平为A1，B3，C3，而影响感官评价水平高低的三因素主次顺序为C＞B＞A，较优的发酵条件组合为A1B3C3，此组合在试验中没有出现，故经过发酵证实，此组合所得成品酒酒精度较高为13.1%，感官评价得分为91.6，亦较高。

6产品指标[7]

6.1产品理化指标酒精（以容量计，20℃）：12.0%±1.0%；总糖（以葡萄糖计，g/L）：≤4.5；总酸（以酒石酸计，g/L）：2.8～4.0；挥发酸（以醋酸计，g/L）≤1.1；游离SO2，mg/L≤50；总SO2，mg/L≤250；干浸出物，g/L≥14；铁，mg/L，8≤Fe3+≤10。

6.2产品感官指标评分标准参照中国葡萄酒品评标准，得分由试验室成员品评后打分，取平均值。感官要求：色泽：紫红色；澄清度：澄清透明，有光泽，无明显悬浮物；香气：具有醇正、清雅、优美、和谐的葡萄果香及酒香；滋味：酸甜适中，醇厚、爽舒。

7结论

本研究一方面从本产区采集的葡萄果粒中分离到酵母株后，经过耐性试验和酒精模拟发酵试验，筛选出发酵性能优良的菌株SY1和SY2，相比普通酿酒酵母发酵产酒率分别提高3.3%和2.9%；另一方面依托原有的葡萄酒生产工艺，选取SY1作为试验菌株，通过改变葡萄汁起始糖度、酵母接种量及主发酵温度的单因素试验及三因素三水平的L9(33)正交试验，最终得出26℃条件下，葡萄汁起始糖度和酵母接种量分别为22°Brix和10%时，所得产品酒精度最高；而当在26℃条件下，葡萄汁起始糖度和酵母接种量分别为20°Brix和10%时，所得产品口感最好。