葡萄球菌毒素检测办法的建立

本文作者：孙茂忠 薛秀恒 王 梅林 吕高婧 徐洪军 单位：安徽农业大学茶与食品科技学院 安徽食品安全分析与检测省级实验室 安徽农业大学动物科技学院

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是引起食品污染和人类食物中毒的一种重要细菌，在自然界中分布较为广泛。其所产生的肠毒素（Staphylococcalenterotoxin，简称SE）是主要的致病因子之一。SE是一类结构，毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，除了SEA，SEB，SEC，SED，SEE五种（其中血清型SEC又分为SEC1，SEC2，SEC3三种亚型）早已被鉴定的传统血清型外，近年来还发现了SEJ，SEK，SEL，SEM，SEN，SEO，SEP，SEQ，和SEU等新型的肠毒素[1-3]。乳及乳制品是金葡菌主要食品宿主，我国生奶中金葡菌的污染率一般在15％～30％之间，奶酪、酸奶等乳制品中金葡菌的检出率也一直居高不下[4-5]。在食品检测中少量或无金葡菌检出，并不能证明不存在肠毒素。因为，金葡菌能在食品中繁殖产生肠毒素，然后在贮存过程中死亡或通过加热处理被杀灭，但其产生的肠毒素却仍能留在食品中[6]。葡萄球菌肠毒素可耐受100℃煮沸30min而不被破坏，并能抵抗胃肠道中蛋白酶的水解作用，造成食物中毒[7]。据报道[8]，每百克食物中含18μgSE时即能引起金黄色葡萄球菌食物中毒。由此可见，检测金黄色葡萄球菌肠毒素比检测细菌本身更为重要。本研究以牛奶中提取的金黄色葡萄球菌所产的肠毒素A为抗体，对獭兔进行常规的免疫注射，获得较高纯度的金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗血清后，建立乳源金黄色葡萄球菌肠毒素A特异性血清间接ELISA检测方法，为后续进一步研究更加快捷、高效的乳源金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法提供依据。

1材料与方法

1.1仪器与试剂弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，透析袋：Sigma公司；肠毒素产毒培养基：青岛海博生物技术公司；脱脂乳：FONTERRA公司；羊抗兔IgG-HRP：上海生工生物公司；TMB•2HCl：上海生工生物公司；96酶标孔板：美国CorningCostar公司；酶标仪：美国柏腾。乳样采集于安徽省某奶站；金黄色葡萄球菌肠毒素：实验室自制。

1.2方法

1.2.1金黄色葡萄球菌肠毒素的分离纯化按照检验标准[9]，对采集的乳样进行金黄色葡萄球菌的分离。然后，从分离出的金黄色葡萄球菌中收获并纯化肠毒素，经SDS-PAGE检验肠毒素类型。

1.2.2金黄色葡萄球菌特异性抗血清的制备将12只雄性獭兔随机分为对照组（10只）和试验组（2只），试验前进行健康观察和预饲养2周，免疫之前心脏采血，作为阴性血清对照。将纯化后的金黄色葡萄球菌肠毒素用无菌生理盐水配成1mg/mL的溶液。取肠毒素溶液和等量的弗氏完全佐剂混合并充分乳化（乳剂滴于水上完全不扩散）后作为免疫抗原，试验组每只每次注射2mL，在颈背部皮内及大腿肌肉处多点免疫。以后每2周以金黄色葡萄球菌肠毒素溶液和等量弗氏不完全佐剂混合并充分乳化作为免疫抗原皮下免疫一次。第4次免疫后以1mL金黄色葡萄球菌肠毒素溶液（不加佐剂）皮下加强免疫，一周后心脏采血。将采集的血液放至在37℃下，1h～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出，经离心沉淀分出血清，加入0.02%NaN3，4℃保存。

1.2.3间接ELISA法测金黄色葡萄球菌特异性抗血清效价（1）抗原包被：将肠毒素固体用包被液稀释至20μg/mL，每孔100μL包被96酶标孔板，4℃过夜，次日倾去包被液，用PBST满孔洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（2）封闭：每孔加入200μL5％脱脂奶（溶于PBST），37℃湿盒1h，倾去封闭液，PBST满孔洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（3）抗原抗体反应：每孔加入100μL以PBST倍比稀释的抗血清（从1︰100倍比稀释至1︰12800）和阴性血清，同时设置空白对照（以PBST代替血清），37℃湿盒1h，PBST洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（4）加酶标二抗：每孔加入100μL的羊抗兔IgG-HRP酶标二抗(以PBST作1︰1000稀释)，37℃湿盒1h，PBST洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（5）底物显色反应：每孔加反应底物100μL显色液反应液，37℃暗盒反应20min。（6）终止反应：每孔加入100μL2mol/LH2SO4，20min后以空白对照孔调零，490nm测吸光值。以抗血清的吸光值2倍于阴性血清的吸光值时，抗血清的最大稀释倍数作为抗血清的效价。

1.2.4金黄色葡萄球菌肠毒素最佳抗体稀释倍数和包被抗原工作浓度的确定（1）抗原包被：包被抗原用包被液（按40，20，10，5，2.5，1.25μg/mL）作倍比稀释，每孔100μL横向加到96孔酶标板中，4℃过夜次日倾去包被液，用PBST满孔洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（2）封闭：同1.2.3。（3）抗原抗体反应：抗血清用PBST倍比稀释（从1︰100倍比稀释至1︰12800）每孔加入100μL，纵向加到酶标板各孔中，同时设置空白对照（以PBST代替血清），37℃湿盒1h，PBST洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（4）以下步骤同1.2.3。

1.2.5金黄色葡萄球菌肠毒素间接竞争抑制ELISA标准曲线的制作（1）抗原包被：包被抗原用包被液稀释至10μg/mL，每孔100μL加到96孔酶标板中，4℃过夜次日倾去包被液，用PBST满孔洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（2）封闭：同1.2.3。（3）抗原抗体反应：抗血清用PBST稀释至1︰1600，每孔50μL加到酶标板各孔中，同时分别加入50μL不同浓度（0，10-2，10-1，1，10，102，103，104ng/mL）的肠毒素磷酸盐溶液，并设置空白对照（以PBST代替），37℃湿盒1h，PBST洗涤3次，每次5min，甩液拍干。（4）以下步骤同1.2.3。以肠毒素磷酸盐溶液的浓度对数值为横坐标，以各浓度孔的OD值为纵坐标，绘制竞争抑制曲线。

1.2.6人工污染样品中肠毒素的回收率测定用鲜奶制备不同浓度的肠毒素污染品，使得鲜奶中肠毒素最终浓度分别为5，10，100，1000ng/mL，10000r/min离心15min，取上清液作为污染样品，用间接竞争ELISA法检测污染品中肠毒素回收率。步骤同1.2.5，用50μL肠毒素污染样品代替肠毒素磷酸盐溶液。用不含肠毒素的鲜奶作空白对照。每个浓度重复4次。回收率=测量浓度/实际浓度×100%（1）

1.2.7间接竞争ELISA法测乳样中SEA含量取5mL采集的乳样，10000r/min离心15min，取上清液，用间接竞争ELISA法检测乳样中肠毒素，操作步骤同1.2.6，用50μL采集的乳样代替肠毒素磷酸盐溶液。用不含肠毒素的鲜奶作空白对照。作4次重复试验。

2结果与分析

2.1金黄色葡萄球菌肠毒素的纯化检测从分离出的金黄色葡萄球菌中收获并纯化肠毒素，经PCR检测，从该乳样中所提取的肠毒素为肠毒素A型。纯化后的肠毒素经SDS-PAGE电泳（图1），可判定符合免疫需求。

2.2金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗血清间接ELISA效价检测采用间接ELISA法对获得的抗血清进行效价检测，结果如表1所示，由表可知特异性抗血清效价达到1︰3200。一般在ELISA测定中，抗体效价在1︰103以上都有应用价值[10]。因此，本研究制备的金黄色葡萄球菌肠毒素A特异性抗血清可用于试验所需。

2.3金黄色葡萄球菌肠毒素间接竞争ELISA检测方法的建立

2.3.1最佳包被抗原浓度和抗体稀释倍数的确定采用方阵点滴法，同时倍比稀释包被抗原及特异性抗血清，选择抗血清的OD值2倍于阴性血清的，并且OD值最接近1时的稀释度为最佳稀释度。由表2可知，当抗原包被浓度为10μg/mL，抗血清稀释倍数为1︰1600时，OD值最接近1。因此，抗体与包被抗原的最佳工作浓度分别为1︰1600和10μg/mL。

2.3.2间接竞争抑制ELISA标准曲线的制作间接竞争法的模型：包被抗原，将抗体与待测样本一起加入。待测样本中游离的抗原与固相抗原竞争有限量的抗体，固相吸附的抗体与样本中的抗原浓度成反比。由此可定性和定量待检样品中的抗原。本研究中把制备的金黄色葡萄球菌肠毒素A用PBS梯度稀释后，根据建立的ELISA方法获得间接竞争ELISA标准曲线（图2）。由图可知，本试验获得的肠毒素A抗血清在1～103ng/mL之间，吸光度与浓度呈现良好的线性关系，回归方程为y=-0.2933x+1.0547，R2=0.9948。

2.3.3人工污染样品中肠毒素的回收率测定用不同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素A污染鲜奶，通过已建立的ELISA标准曲线以间接竞争ELISA法计算得肠毒素的回收率。从表3结果可以看出，肠毒素A在5～1000ng/mL的添加量时，回收率在98.9861%～103.3475%之间，变异系数逐渐减小，在3.053%～11.5929%之间，可基本用于实际测量。

2.3.4间接竞争ELISA法测乳样中SEA含量通过间接竞争ELISA法，测得所采集的乳样中金黄色葡萄球菌肠毒素A的浓度（表4）。

3结论

本研究从安徽省某生奶供应站采集的乳样中分离筛选出金黄色葡萄球菌，并获得其所产的肠毒素A。将其作为免疫抗原，进行常规免疫程序后，获得较高纯度的肠毒素A特异性抗血清。间接ELISA测得其效价为1︰3200。采用方阵点滴法确定了抗体与包被抗原的最佳工作浓度分别为1︰1600和10μg/mL。本研究建立的乳源金黄色葡萄球菌肠毒素间接ELISA检测方法线性检测范围为1～103ng/mL，相关系数为R2=0.9948，人工污染样品肠毒素的回收率在98.9861%～103.3475%之间，可基本用于实际测量。本方法只需制备一种抗体，且不需纯化，可直接应用。通过该特异性的抗血清，为进一步制备高效、快捷的肠毒素检测技术，加强乳品质量安全奠定了基础。