时间：2022-09-19 06:56:12
本文作者：焦岩 常影 刘井权 单位：齐齐哈尔大学 齐齐哈尔大学食品与生物工程学院
沙棘（HippophaerhamnoidesL.），别名醋柳、黄酸刺、酸刺柳、黑刺、酸刺，为胡颓子科（Elaeagnaceae）沙棘属（HippophaeLinn.）多年生落叶灌木。原产我国及欧洲，分布于欧亚大陆的温带、寒温带及亚热带高山区，以苏联、蒙古、中国分布最多[1]。沙棘果无污染，味酸甜，主要含有糖、微量元素，特别是含有类胡萝卜素、维生素C、维生素E等许多营养成分。沙棘中还含有上百种生物活性物质，氨基酸、多糖类、脂肪酸、黄酮类、SOD、5-羟色胺、萜类及甾体类等。其中沙棘黄酮是沙棘中重要的活性成分，沙棘黄酮具有清除自由基、抗衰老功、抗肿瘤、增强免疫、抗疲劳、改善心脑血管等多种生理功能[2]，可开发为功能性食品或作为医药保健产品的原料。近年来，许多新技术和新方法广泛应用于沙棘黄酮的制备工艺研究，包括提取工艺及分离纯化工艺，这些技术方法为进一步开发以黄酮提取物为原料的沙棘产品奠定了基础。
1沙棘黄酮的提取技术研究
1.1热水提取法热水提取法提取黄酮类物质具有提取方法简单容易掌握，对提取设备要求不高，提取成本投入较低等优点。由于没有使用酸、碱和有机溶剂等具有腐蚀性、易燃易爆物品，因此安全性较好，对环境污染小。例如：王尚义等[3]将沙棘叶清洗去杂、干燥粉碎、石油醚脱、热水浸提、过滤、滤液调pH值、沉淀、水洗至中性、乙醇淋洗、滤液浓缩、沉淀、过滤、干燥，得沙棘黄酮产品；苏琳等[4]把沙棘叶粉脱脂后，加碱后水提。水提黄酮方法简单，但是由于大多数黄酮类物质在水中溶解度较小，热水提取法仅能对黄酮苷类物质提取，提取温度要求相对较高，提取后浓缩比较困难，对黄酮提取效率相对其它溶剂较低，所以热水提取法在实际生产过程中应用相对较少。
1.2有机溶剂提取法黄酮类化合物属多环多元酚类，具有多羟基结构，具有较大的极性，可溶于热水，甲醇，乙醇，丙酮，乙酸乙酯等溶剂中，而难溶于石油醚、正己烷，苯，氯仿等非极性有机剂。所以甲醇，乙醇，丙酮，乙酸乙酯常用来黄酮类化合物的提取。但是由于丙酮、乙酸乙酯提取率不高，成本高，甲醇毒性、挥发性较大，因此一般采用乙醇作为提取剂。由于乙醇能够很好的穿透植物细胞壁，且毒性小，价格便宜，易于回收，用乙醇溶液从植物中提取黄酮类化合物的研究较多，例如王昌利等[5]采用水提法、乙醇直接提取法、脱脂后醇提法、滤液调pH值、沉淀、饱和石灰水或乙酸乙酷溶解、干燥，得沙棘黄酮产品。刘锡建等[6]采用乙醇为溶剂对研究了从沙棘果渣中提取黄酮的工艺，总黄酮得率高达0.5344%。
1.3微波辅助提取法微波是一种频率为300MHz~300GHz的电磁波。由于它是一种瞬时穿透式加热方式，在微波场的作用下，原料中的水分吸收微波能，迅速蒸发膨胀，在其表面形成无数的细小孔隙，这些孔洞大大提高了原料内成分的渗出，从而加快了萃取速度。近年来微波技术在植物有效成分的提取方面得到了广泛的应用[7]。陈金娥等[8]采用微波萃取技术提取萃取法浸提沙棘黄酮，产率为3.697mg/g，证明微波萃取法黄酮产率高、省时、溶剂用量少、耗能低等优点。赵二劳等[9]以体积分数70%的乙醇为萃取液，用单因素分析与正交试验相结合的方法,研究了微波萃取沙棘叶黄酮的最佳条件，沙棘叶中黄酮得率为3.068mg/g。刘宝沛等[10]应用天水华园制药设备有限责任公司提供的微波提取设备，从沙棘果渣(果肉)中提取沙棘总黄酮，证明了微博具有提取率高、酒精损耗少、耗电量低、缩短提取时间、无醇不溶残留之特点，可大幅度降低综合成本。彭游等[11]考察了沙棘黄酮的微波光波组合无溶剂提取方法，发现微波光波提取干法不用溶剂，仅用微量的N,N-二甲基酰胺(DMF)作为能量传递介质，提取速度较传统回流提取法明显加快，成本明显降低。微波萃取技术具有设备简单，节省时间，投资少，萃取效率高，污染小等优点。但在还处于起步阶段，提取技术和设备都有待与进一步研究和改进。
1.4超声波辅助提取超声波是一种弹性机械振动波，它产生强烈振动，高速度，强烈的空化效应，搅拌作用。因此，能破坏植物药材的细胞，使溶媒渗透到药材细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解，以提高有效成分的提取率。研究表明，超声波在提取植物活性物质方面取得了良好的效果，用超声波法提取桔皮黄酮，甘草黄酮，黄芪黄酮，葛根黄酮，得到了较高的提取率[12]。姜少娟等[13]采用超声波提取法从沙棘果渣中提取总黄酮，并与传统热回流提取法进行了比较，结果表明超声提取法明显优于传统热回流提取法。陈金娥等[14]采用超声波法浸提沙棘黄酮最优工艺条件，结果表明具有产量高、省时、溶剂用量少、耗能低等优点。刘高波[15]利用超声波法提取沙棘总黄酮，优化超声波提取最佳工艺，总黄酮得率为0.4829%。结果表明，超声波提取沙棘果渣时间短、能耗低可降低生产成本，提高经济效益。
1.5酶法提取植物的有效成份往往包裹在细胞壁中，可用酶将细胞壁或细胞膜破坏放出来，再进行进一步的提取分离。此法较其他方法更为温和，提取率相对成本较低。常用的酶主要有纤维素酶、果胶酶等。通过酶反应可在较温和的条件下将植物组织分解，加速有效成分的释放，还可将影响药物制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解去除，具有专属作用强、无有机溶剂消耗和环境污染、效率高等特点。用酶法提取植物黄酮得到了较好的效果[16-17]。
2黄酮类化合物的纯化
2.1大孔吸附树脂纯化法大孔吸附树脂包含许多微观小球组成的网状孔穴结构，因此颗粒的总表面积很大。根据树脂的表面性质，引入一定的极性基团，树脂可分为非极性、中极性和极性三类，极性使大孔树脂具有了更好的吸附能力和吸附选择性。因此，不同有机化合物因其极性和分子量的不同，可在大孔吸附树脂上实现分离与纯化。大孔吸附树脂对分离对象具有选择吸附与分子筛作用，它的吸附性是由于范德华力或氢键作用。王建国等[18]用大孔树脂纯化吸附精制沙棘籽黄酮，采用AB-8型大孔树脂，吸附30min，60%乙醇4倍树脂体积解吸附,流速为5mL/min,得到沙棘籽黄酮纯度达21.03%，转移率81.67%以上。曹群华等[19]用大孔树脂吸附纯化沙棘籽渣总黄酮，D101大孔树脂对沙棘籽渣总黄酮的吸附性能最好，并得到了D101大孔树脂对沙棘籽渣总黄酮吸附纯化的最佳条件。欧来良等[20]考察FL-1多功能吸附树脂对沙棘叶中总黄酮的分离纯化方法。结果FL-1树脂对沙棘叶总黄酮具有较高的吸附选择性，体积分数70%乙醇作为脱附剂,产品中总黄酮含量为40.2%。张静泽等[21]研究配位吸附树脂在非水体系中对沙棘中黄酮类成分的吸附情况，结果表明经配位吸附树脂吸附分离后沙棘提取物中黄酮纯度由14.93%提高到55.74%，起到纯化精制的目的。树脂不需要再生，连续使用吸附性能稳定。
2.2薄层板色谱（TLC）分离黄酮类化合物所用的吸附剂，主要有硅胶、聚酰胺、纤维素。TLC是50年代由经典柱色谱和PC发展而来，至今仍然广泛用于复杂体系如天然产物分析中。近20年来，层析法获得了迅速的发展，它不仅用于混合物的分离，也可用于检定成品的纯度，即能用于定性，又能用于定量。TLC法操作简便、快速，不需要贵重的仪器设备，杂质对色谱系统的干扰破坏小，分析成本较低，但分析时间较长，定量分析结果重现性较差，操作繁琐，限制了它在定量分析中的应用[22]。冯玛莉等[23]采用薄层色谱法以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)为展开剂，在硅胶GF254薄层板上展开，紫外光灯(254nm)下检视，检出沙棘黄酮所含主要化合物槲皮素、异鼠李素。梁淑芳等[24]通过聚酰胺薄层色谱,考察了微乳液类型对沙棘黄酮分辨率的影响。选择含水量70%的微乳液作为展开剂，检测灵敏度显著提高，分离效果理想。
2.3聚酰胺柱层析对有机物的吸附属于氢键吸附，吸附强度取决于黄酮类分子中羟基的数目、位置和溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱层析可用于分离各种类型黄酮类化合物。聚酰胺的吸附作用是通过酰胺基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生的。聚酰胺柱层析法分离效果好，样品容量大，适于在制备分离工艺中应用。但洗脱速度慢，死吸附较大，常有低分子量酰胺的低聚物杂质混入。张素敏[25]用聚酰胺柱层析结合高效液相色谱进行单体化合物的分离，但提取时溶剂比例(5∶5∶3∶3∶1)、分离时聚酰胺粉目数(80~100目)和上样量(常规的1/4)与传统有所差别，从蒙古沙棘的果实中分离得到了3个黄酮单体化合物，实验操作流程简单，适合于工业化生产。
2.4硅胶柱色谱此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢异黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化的黄酮及黄酮醇类。在硅胶降活后也可用于极性较大的黄酮类化合物的分离，如黄酮苷类和多羟基黄酮类化合物。在硅胶柱上分离黄酮苷元时，用氯仿-甲醇混合液做洗脱剂，分离时用氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶1)或(65∶20∶2)和(80∶18∶2)做洗脱剂，可获得较好的分离效果。党权等[26]用沙棘果实的提取物，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取物经硅胶柱，用氯仿-甲醇梯度洗脱以及SephadexLH-20凝胶甲醇洗脱，分离得到4-羟基苯甲酸、苹果酸甲酯等9个化合物。张益娜[27]采用硅胶柱色谱法，从沙棘叶乙酸乙酯萃取物分离得到2个纯品，利用薄层层析法紫外光谱鉴定法及高效液相色谱鉴定，分别为芸香苷、异槲皮苷。
2.5葡聚糖凝胶柱层析法主要依靠分子筛作用分离黄酮苷类。在洗脱时，一般按分子量的大小顺序洗出柱体。对于分离黄酮类化合物，主要用两种型号的凝胶：Sephadex-G型及Sephadex-LH20型。其中Sephadex-LH20的洗出液中不含有杂质，所以适用于从纸色谱分析、硅胶及聚酰胺柱色谱中分离出来的黄酮类化合物糖苷配基及糖苷的最终纯化，但分离黄酮苷时，则分子筛起主导作用。一般说来，黄酮苷元游离酚羟基越多，越难洗脱；相对分子量越大，苷元上连的糖越多，越易洗脱。葡聚糖凝胶柱层析中常用的溶剂系统有：①醇溶液，如甲醇、乙醇及不同比例的含水醇；②水溶液，如水、碱性水溶液(0.lmol/LNaOH)、盐溶液(0.5mol/NaCl)[28]。陈海芳[29]研究了沙棘叶乙醇提取物正丁醇相部分，运用硅胶柱层析和sephadex-LH20柱分离鉴定了8个单体化合物。姜少娟[30]应用硅胶柱层析和SephadexLH-20柱层析配合使用对沙棘总黄酮乙醇提取物进行了进一步的分离纯化，共分离出四个化合物。
2.6逆流色谱分离Tian-youzhang等[31]曾经报道采用逆流色谱来分离沙棘(总)黄酮，用乙醇的提取的(总)黄酮粗品，在氯仿，甲醇，和水之比为4∶3∶2的两相溶剂中用逆流色谱分离，得到异鼠李素、棚皮素、山奈酚等五种成分，这种方法主要用于分析沙棘(总)黄酮的成分和得到黄酮标准品，一般不用于工业化大规模提取黄酮，因为成本太高。
3结语
近年来，很多高新技术已被广泛应用于沙棘黄酮的提取与分离制备中，取得了大量研究成果，有助于提高沙棘及副产品的精深加工水平和产品附加值。但多数研究仅限于实验室水平，有待于根据生产实际，结合设备选型，通过中试研究得到成熟的工艺技术条件，最终实现沙棘黄酮的产业化生产。