基于分子对接的祛湿药抗衰老活性成分筛选及作用机制解析

[摘要] 湿乃万病之源，湿邪易引起疾病、促进衰老，衰老也会促进疾病的发生发展。该文探讨湿邪与衰老的关系，发现祛湿中药中抗衰老的活性成分，对祛湿药的抗衰老作用进行机制解析。该文通过分子对接技术，以与衰老相关的雷帕霉素靶蛋白为对接受体，以茯苓、桑枝、木瓜、薏苡仁和厚朴5味祛湿药中的化学成分为对接小分子，初步筛选祛湿药中的抗衰老活性成分。与已上市雷帕霉素抑制剂坦西莫司及依维莫司对比，分析得到12种潜在的抗衰老的活性成分，这些成分的成药性有待进一步考察。分子对接结果表明祛湿药中多种成分可以通过作用于雷帕霉素靶蛋白而发挥抗衰老的活性，该结果为从湿论治延缓衰老提供了新的思路和方向。

[关键词] 抗衰老；祛湿药；湿邪；分子对接

[Abstract] Dampness evil is the source of all diseases， which is easy to cause disease and promote aging， while aging could also promote the occurence and development of diseases. In this paper， the relationship between the dampness evil and aging would be discussed， to find the anti-aging active ingredients in traditional Chinese medicine （TCM）， and analyze the anti-aging mechanism of dampness eliminating drug. Molecular docking technology was used， with aging-related mammalian target of rapamycin as the docking receptors， and chemical components of Fuling， Sangzhi， Mugua， Yiyiren and Houpo as the docking molecules， to preliminarily screen the anti-aging active ingredients in dampness eliminating drug. Through the comparison with active drugs already on the market （temsirolimus and everolimus）， 12 kinds of potential anti-aging active ingredients were found， but their drug gability still needs further study. The docking results showed that various components in the dampness eliminating drug can play anti-aging activities by acting on mammalian target of rapamycin. This result provides a new thought and direction for the method of delaying aging by eliminating dampness.

[Key words] anti-aging；drugs of eliminating dampness；dampness evil；molecular docking

doi：10.4268/cjcmm20161325

湿邪是中医病因学说独有的概念，具有4个特征：湿性重浊；湿为阴邪，易阻遏气机，损伤阳气；湿性黏滞；湿性趋下，易袭阴位[1]。现代生活中冠心病、糖尿病、类风湿关节炎、高血压等危害公众健康的几种重大疾病均与湿邪有关。

冠心病心绞痛属于中医胸痹范畴，近年来随着对冠心病认识的加深，痰瘀论在冠心病的治疗上得到了广泛认可。冠心病常见的病理过程就是由湿生痰，由痰致瘀，因此对冠心病从湿论治，在痰瘀形成之前，对湿邪进行干预，能起到既病防变的良好效果[2]。根据中医“治未病”的理论，现代中医治疗冠心病就应该从湿论治[3]。

糖尿病属于中医消渴的范畴，近年来，有关糖尿病的辨证论治研究的不断深入，尤其从湿热论治糖尿病成为该研究领域的热点。现代中医学家普遍认为，湿热证在糖尿病发生发展过程中不可忽视[4]。当“脾失运化”，体内的湿邪就会停留、积聚，日久就会发热，由湿邪转化为湿热之邪。湿热内蕴，困阻胰脏，胰岛细胞萎缩、功能减退，不能正常按需分泌胰岛素，不能把血糖稳定在正常范围内，血糖升高，从而引起糖尿病发[5]。

类风湿关节炎属于中医痹症，有医家认为，患者无论寒热虚实，均与湿邪有关[6]，在疾病早期，痰瘀尚未形成，但痰浊的早期即为湿邪，湿性重浊粘滞，湿邪为患日久可转化为痰浊；而瘀血的早期则为血运失调，血行不畅日久则转化为瘀血，痰瘀胶结，病程缠绵反复。故而在本病的早期应注意预防痰瘀的形成[7]，湿邪入体可能引起机体免疫功能的障碍[8]。

阿尔茨海默症在中医认识中，属于“呆病、健忘、虚劳、善忘”等范畴，病因分为实证和虚证，属实者则多为水蕴内停，湿聚生痰，上蒙清窍所致[9]。水湿不化，痰浊始生，则会对认知能力产生影响[10]。

由此可见，湿邪是引起疾病的多种因素之本。而衰老是一个积累有害物质、导致重要功能丧失和有机体生理状况恶化的过程，最终也会导致疾病与死亡[11]。与衰老相关的疾病有神经退行性疾病阿尔茨海默症、帕金森等，代谢综合征肥胖、糖尿病、冠心病、肾功能受损等，年龄相关性眼病白内障，黄斑病变、糖尿病视网膜病变等，肿瘤乳腺癌、肾细胞癌等，免疫系统疾病移植后排斥反应、自身免疫性疾病，退行性骨关节炎等[12]。张宇享[13]在分析内经中论述的衰老机制时指出关于衰老的湿邪瘀阻说，认为湿邪入侵会严重损害身体健康，耗散卫气，阻闭气血输送转运，影响机体代谢，引起诸多病变，最终导致阳气渐虚，阴邪渐增，脉络阻滞，疾病产生，促进衰老。因此从祛湿的角度出发不仅能够辅助治疗与湿邪相关的疾病，同时能够达到延缓衰老的目的。

已报道的抗衰老信号通路主要是胰岛素/胰岛素样生长因子1信号通路（IIS）、TOR信号通路、AMPK信号通路、Sirtuins通路[14]。报道较多且研究较清楚的mTOR信号通路，研究表明，多种疾病（如癌症、糖尿病、心血管疾病及神经功能紊乱等）与mTOR信号通路失调有关[15]。mTOR信号通路异常活跃会引起这些疾病，这就使mTOR抑制剂产生巨大的潜在应用价值[16]。传统的mTOR抑制剂是雷帕霉素及其衍生物[17]。雷帕霉素与细胞中的受体FKBP12（FK506结合蛋白12）结合形成FKBP12-雷帕霉素复合物再与mTOR靶蛋白的FRB区域相结合，抑制mTOR的激酶活性，从而阻断mTOR信号通路的传导[18]，从而达到抗衰老的目的。但是雷帕霉素是一种大环内酯类化合物，存在生物利用度差、水溶性差的缺点。因此，寻找更多的生物利用度高，水溶性好的抗衰老药物具有现实意义。通过雷帕霉素抑制mTOR靶蛋白的原理可知，小分子与FKBP12结合即可以抑制mTOR信号通路的传导[19]。

笔者选取祛湿药中茯苓[20]、桑枝[21]、木瓜[22]、薏苡仁[23]、厚朴[24]为研究对象，这5味中药均有报道证明其具有抗衰老的活性。因此，本研究旨在采用分子对接方法，以mTOR靶蛋白为对接受体，以5味祛湿药的化学成分为对接小分子，快速筛选祛湿中药中抗衰老的活性成分，对祛湿中药抗衰老的有效成分和作用机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料来源

通过整理汇总中国知网数据库提供的近3年的文献数据，找出祛湿药中具有抗衰老作用的中药主要是茯苓、桑枝、木瓜、薏苡仁、厚朴，5味药在《中国药典》均有收载。

1.2 抗衰老靶点的选择及结构准备

本研究以雷帕霉素靶蛋白为分子对接的受体，靶蛋白三维结构从蛋白质数据库PDB中搜索，选择了PDB代码为1NSG的蛋白质（复合了雷帕霉素的靶蛋白）结构文件作为分子对接研究的载体。利用Discovery Studio 4.0对蛋白质结构进行处理，进行删去配体小分子和水分子及多余构象、加氢后，最后保留蛋白质A链用于分子对接。

1.3 中药小分子的数据库准备

以已经确定的5味中药的化学成分构建中药小分子数据库。在TCMD数据库中收录5味中药分别包含的化学成分，其中茯苓的化学成分34个，桑枝的化学成分23个，木瓜的化学成分80个，薏苡仁的化学成分38个，厚朴的化学成分139个。将所有小分子保存为mol2格式文件，用于后续的分子对接。

1.4 分子对接

1.4.1 靶点活性口袋的确定 将1NSG蛋白质与雷帕霉素发生相互作用的部位初步定为活性口袋，利用CDOCKER工具将雷帕霉素对接到原蛋白的活性口袋，根据配体对接构象与晶体结构中配体之间的均方根偏差（RMSD）的大小判断对接程序参数设置的合理性及对该晶体复合物的适用性，RMSD值越小，对接效果越好[25-26]。认为RMSD

1.4.2 各靶点与已上市药物、中药小分子的对接 利用Cocker工具将各靶点与其已上市药物、中药小分子对接，参数及活性口袋设置均参照1.4.1项的记录结果。在DrugBank数据库中以靶点名称为关键词搜索并下载已上市药物，包括mTOR靶蛋白抑制剂2个：坦西莫司（temsirolimus）、依维莫司（everolimus）。分别将其与设置好参数的活性口袋对接，用Analyze Ligands Pose模块分析对接过程中靶点与活性药物分子相互作用的关键氨基酸，为建立筛选规则、分析化合物与靶点相互作用的合理性提供依据。中药小分子数据库与各靶点对接计算完成后，对于同一靶点，将对接成功的构象按-Cdocker interaction energy和-Cdocker energy为评价指标，以1.4.1项中所记录值的80%作为阈值，寻找打分值高于阈值的化合物，若此化合物与靶点相互作用方式与已上市药物的作用方式接近，则认为是作用于靶点的活性化合物。

2 结果与分析

2.1 靶点活性口袋及相应计算结果

对接过程中靶点活性口袋信息为：半径14.461 5，坐标-9.204，26.799，36.720，均方根偏差为1.130 9。

2.2 已上市药物与靶点对接

统计已上市药物与靶点相互作用的关键氨基酸，发现主要非键相互作用为氢键相互作用和疏水相互作用，具体结果见表1。

活性化合物筛选规则：化合物的打分值达到阈值（阈值=打分值×80%），且分子对接过程中必须与产生主要非键相互作用的3个或3个以上氨基酸发生相互作用，并选择性地与产生静电作用的关键氨基酸作用。

2.3 中药小分子对接结果分析

中药化合物与靶点对接的结果见表2。

根据2.2项中的活性化合物筛选规则，中药小分子满足该规则的化合物有12个，按表2的顺序这些化合物分别是棕榈酸、麦角甾醇、异榄香素型、玉兰素、去甲氧基姜黄素、正十四碳烷、木犀草素、三十烷醇、常春藤皂苷、羽扇豆醇乙酸酯、氧代千层塔烯二醇、褪黑素。其中棕榈酸为茯苓和薏苡仁共有的成分，麦角甾醇、异榄香素型化合物为茯苓中所含的成分，玉兰素、去甲氧基姜黄素、正十四碳烷为薏苡仁中的成分，木犀草素、三十烷醇、常春藤皂苷为桑枝中所含有的成分，羽扇豆醇乙酸酯、氧代千层塔烯二醇为木瓜中的成分，褪黑素是厚朴的成分。

现以木犀草素（MOL00745）与雷帕霉素靶蛋白的作用为例分析中药小分子与靶蛋白之间的相互作用。木犀草素与雷帕霉素靶蛋白发生相互作用的关键氨基酸是与A：GLU54，A：GLN53，A：TYR82， A：ASP37发生氢键相互作用，与A：HIS87，A：PHE46，A：ILE90，A：VAL55发生疏水相互作用，与上文分析

的已上市药物及原配体与靶蛋白作用的关键氨基酸相似，由此推测木犀草素与已上市药物抗衰老的作用机制相似，具有相似的生物活性。然而，化合物棕榈酸（MOL00069）与靶蛋白作用的关键氨基酸虽有A：TYR82，A：HIS87，A：PHE46发生氢键作用，A：PHE46，A：ILE56，A：ILE90发生疏水作用，但相关研究表明棕榈酸能够促进人成骨肉瘤细胞MG63细胞的凋亡[27]，且棕榈酸可以通过多种途径产生毒性作用[28]，所以推测其为假阳性结果。

利用分子对接技术对祛湿药中的抗衰老成分进行筛选发现，祛湿药中多种化合物可以作用于雷帕霉素靶蛋白，通过干预mTOR信号通路起到抗衰老的作用。

3 讨论

近年来，分子对接技术在先导化合物的发现[29]、潜在靶标和作用机制的探索[30]以及中药复方药理机制[31]的研究方面均表现出一定的优势。本研究通过分子对接技术筛选祛湿药中具有抗衰老作用的活性成分，其中有部分化合物如去甲氧基姜黄素[32]、木犀草素[33]、褪黑素[34]等已有文献报道具有抗衰老作用，这些报道与本实验对接结果相互佐证，表明本研究方法具有一定的可靠性。对接结果中也有部分成分至今没有明确的系统的研究，实验结果为抗衰药物的开发提供了更多的方向和思路，研究人员可以针对这些成分进行药理学和毒理学研究。但本研究也有一定的局限，分子对接仅考虑原子间相互作用，以此来推测复杂的生物体系显然是不够的[35]，而且评价方法也具有一定的缺陷，有些得分较高的分子未必就具有较好的生物活性，因此计算结果并不能代替实验数据，最终还是需要生物学实验加以验证。无可厚非，采用分子对接筛选祛湿药中的抗衰老活性成分的方法是可行的，今后笔者会对评价方法进行优化并采取生物学实验对结果进行验证。

本文利用分子对接技术，分析了祛湿药中具有抗衰老活性的成分，结果筛选出多种成分均能够通过作用于雷帕霉素靶蛋白发挥抗衰老的作用。该结果初步阐明了祛湿药能够产生抗衰老的作用，与中医理论中湿邪瘀阻导致衰老的学说相一致。由此，该结果为从湿论治延缓衰老提供了一个新的方向，为湿邪及衰老引起的疾病的预防和辅助治疗提供了新的思路，也为进一步从中药中发现潜在的抗衰老活性成分提供了依据和指导。

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