甘蔗茎尖脱毒组织培养技术研究

摘要 主要采取不同的热处理、接种、茎尖解剖等阶段设计对提高甘蔗的茎尖膜毒组织培养的成功率进行研究，结果表明，对不同的甘蔗品种进行热处理时水浴温度和时间不同；在甘蔗的茎尖解剖前，先用75%的酒精做茎尖消毒，能够在很大程度上减少茎尖培养过程中出现的各种污染问题；接种时，将茎尖放置在浓度为150 mg/L的PVP溶液或者无菌水中浸泡15 min可减少酚污染，且150 mg/L的PVP对甘蔗接种具有促进作用。其中对于活性炭的使用要更加慎重，需要进一步研究。

关键词 甘蔗；茎尖；脱毒；组织培养技术

中图分类号 S566.1；Q813.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）01-0101-02

甘蔗与其他的很多农作物相似，是一种无性繁殖的作物，它主要是利用自身的茎尖来实现自我繁殖，但是经过连续的种植以后很容易出现枝干感染以及体内的病毒积累。有研究表明所有健康的甘蔗品种在种植5年以后必然会感染宿根矮化病。即使是十分优良的甘蔗品种经过多年种植以后，也会受到外界病毒的感染，这在很大程度上影响其优良品种的特性，最终影响整个甘蔗生产的实际产量。在很长一段时间甘蔗的茎尖脱毒培养技术一直是困扰着生物科研人员的问题，在过去的研究中，一般都采取热处理同时结合茎尖分生组织培养的方法进行甘蔗的脱毒，但是由于时间较长，在培养中容易出现污染以及褐变等问题会降低培养的成功率。基于这种情况笔者采取新的甘蔗茎尖脱毒培养技术来提高甘蔗的生产率[1-2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择生长期为6～8个月的果蔗拔地拉和糖蔗（ROC22），以上品种在桂西北地区均有种植。

1.2 试验方法

1.2.1 热水处理。分别在果蔗拔地拉和糖蔗（ROC22）的甘蔗地里随机选取40个形状大小相同的单芽茎断，每个茎断切成三等分，每种样品分3组，每组40个。将这3组分别采取不同的处理方法，其中2组分别放在50、52 ℃中浸泡相同的时间（30 min），而另外一组不做任何处理（CK）。然后取出充分晾干，进行培养（采用新沙），培养温度保持在38～40 ℃，然后每天进行适当浇水[3-4]。经过7 d后详细统计生长和出牙情况。

1.2.2 接种前处理。在沙床上选择长度为10～15 cm的甘蔗幼苗，用清水将幼苗上的泥沙清除干净，同时避免损伤到幼苗，晾干后再等分成3组，为了更好地研究，需要每组15株，然后放到超净工作台上进行处理，第1组采用75%酒精处理，第2组利用无菌水处理，第3组不采取任何的处理。对每组分别进行茎尖皮剥离，剥离到外皮的最后一层，然后切片，长度在1～2 mm之间，最后全部放到已经灭菌的培养皿中。等到7 d后记录甘蔗幼苗污染率和生长情况。

1.2.3 减少酚污染的处理。在第1组操作基础上对茎尖采取4个不同的处理方法。第1种是直接放到无菌水中浸泡；第2种是放到浓度为150 mg/L的PVP溶液中持续浸泡15 min，然后将这2种方法处理后的茎尖放到普通的培养基中进行培养；第3种是将没有经过任何浸泡茎的尖接种到含有碳粉的培养基中；第4组作为对照组不进行任何处理直接放在普通培养基中培养。观察这4组茎尖的生长情况记录污染、褐变情况。

1.2.4 培养基的配置。普通培养基配置MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，以上作为基本培养基，其他需要作对照的组加上对应物质即可，对以上培养基每瓶加上4层的滤纸，每瓶按8～10 mL加入适当的液体培养基，要保证滤纸不被浸没。

1.2.5 培养方式。培养容器选用透明玻璃瓶，容积以200 mL为宜，所有处理都要放在光照强度为1 200～1 500 lx、温度在25～30 ℃、相对湿度达到56%～80%的培养室中进行10～12 h的培养[5-6]。

2 结果与分析

2.1 不同温度热水处理对甘蔗出芽率的影响

从表1可以看出，ROC22在50 ℃和52 ℃时，其出芽率均为77.5%，但是不做任何处理时其出芽率可以达到100.0%，这说明了进行水浴会影响到其出芽率，但影响的程度不大。但是果蔗的出芽率受到的影响比较大，在50 ℃的水浴中出芽率是50.0%，升高2 ℃后出芽率降为25.0%，不进行任何处理的出芽率为90.0%。其主要原因是，果蔗的茎尖组织与ROC22相比更嫩，受到的温度影响更大。进行水浴时茎尖的组织会被烫死，导致出芽率下降。

2.2 不同前处理对甘蔗茎尖培养污染率的影响

通过表2观察发现，以上2个品种没有经过前期处理的茎尖其污染率都达到了50%，而采用酒精或者是无菌水处理后的茎尖其污染率都有明显的下降。经过处理后的2种对比发现经过酒精处理后的污染率明显较低，这说明酒精处理后的茎尖具有消毒作用。作为茎尖解剖中其操作过程是非常细致的，操作人员需要一层层解剖，在解剖中越彻底酒精达到的部位就越广，同时，如果不进行消毒处理茎尖受到的污染就会更加严重，当然受到感染的概率就会越大。因此，甘蔗消毒越彻底，受到的污染就会越小。可是在其中也出现了另一个问题，过度消毒会对甘蔗组织造成不同程度的毒害，由于茎尖组织是非常脆弱的，一旦进行彻底的消毒就会对茎尖组织造成较大的毒害，所以在表2中可以看到经过酒精处理的茎尖出现褐变的概率明显增加。

2.3 不同处理对甘蔗茎尖及褐变率的影响

出现酚污染的原因是茎尖的切口处会分泌出一些酚类物质，而这些物质主要成分会在有氧气的情况下发生一系列的反应，最后变成醌类物质。其中醌这种物质呈黑褐色，是一种有毒物质，附着在切口的表面，不仅影响到切口位置的营养吸收，而且还会对切口位置造成巨大毒害作用，使得茎尖位置变成褐色进而逐渐失去活性。这也是影响茎尖培养中成活率的重要因素之一，同时如果能够减少酚类物质的污染就会减少茎尖的褐变，提高其存活率。从表3可以看出，采取的试验处理均延迟了酚类物质的污染，到第3天才会出现褐色。而在以后的生长中酚污染会出现逐渐加重的现象。对于这个问题需要对其滤纸每天移动位置来达到减少污染的目的。根据肉眼观察发现，除了对照组，其他组的污染情况均没有太大的差异。但是到了第7天后，酚污染问题逐渐出现，将这些茎尖转移到新的培养基中，如果这些茎尖依然再次呈现出绿色，那么这些茎尖在未来的成活率则较高。14 d后，茎尖就开始再次冒出新的绿芽，开始出现分支。到了20 d后，这些新芽长度就会延长至3 cm，此时整个茎尖就可以完全存活下来。

在培养过程中，如果整个茎尖受到严重的酚污染情况，在切口处就会慢慢地变成褐色，最后失去活性而死亡，这个过程被称为褐变。从表3可以看出，ROC22经过4种方法处理，采用PVP和无菌水浸泡其效果更加明显，它们的褐变率分别是20.0%和26.7%，但是使用活性炭取得效果则较为欠佳，其褐变率达到40.0%，这个结果与对照组没有太大的差别。在果蔗中效果最好的也是PVP经过处理后期褐变率只有6.7%，接下来是无菌水，其褐变率是13.3%，采用活性炭处理后效果相对较差，但是最差的是未经过处理的。分析发现，不管是拔地拉或者ROC22采用PVP进行浸泡后出现的褐变率都有明显的降低，而且经过处理后茎尖在以后的生长中具有促进作用，这一点通过茎尖成活率就可以体现出来。而造成这种褐变率差异较大的原因是：首先，PVP可有效地阻止茎尖组织及的细胞中酚类物质出现氧化的现象，降低褐变概率；采用无菌水后清洗切口处的酚类物质，有助于减少酚类物质的污染；活性炭可降低醌类物质吸附环节感染程度，同时也有助于降低其褐变率。

3 结论与讨论

在本次研究中，结合过去试验经验，在此基础上改进试验操作步骤。在此次研究中考虑的方面更加全面，操作要求更高，同时操作的难度也有所加大。但是得出的结果更加科学、合理、客观，为以后甘蔗的茎尖脱毒组织培养技术提供了有效依据。并且在此次研究中发现，在对不同的甘蔗品种进行热处理时水浴温度和时间不同，为以后甘蔗茎尖培养起到了一定的指导作用。

4 参考文献

[1] 唐红琴，方锋学，韦金菊，等.甘蔗茎尖脱毒组织培养技术研究进展[J].南方农业学报，2011（8）：860-865.

[2] 王俊刚，张树珍，杨本鹏，等.甘蔗茎尖脱毒组培苗保绿实验的研究[J].生命科学仪器，2010（8）：14-16.

[3] 刘丽敏，李松，戴友铭，等.甘蔗茎尖脱毒培养技术研究[C]//中国作物学会甘蔗专业委员会第十三次学术讨论会，2008：18-20.

[4] 武媛丽，昝丽梅，张树珍，等.不同光照强度及温度对甘蔗脱毒原种苗增殖效果的影响[J].热带农业科学，2015，35（7）：14-18.

[5] 淡明，李松，刘丽敏，等.甘蔗健康种苗组培快繁技术的研究进展[J].安徽农业科学，2011，39（6）：3165-3166.

[6] 陈敏敏，孙建.甘蔗茎尖脱毒及再生苗扩繁中培养条件的优化[J].上海农业学报，2015，31（3）：35-39.