影响牛胚胎移植妊娠率的主要因素分析

摘要：近年来随着对影响胚胎移植妊娠率的胚胎质量、供受体同期性、受体体况、受体年龄、营养状况、胚胎移植时间、移植部位和环境条件以及移植后受体的饲养管理等诸多因素的不断深入研究，使该技术被广泛应用于牛羊等动物的良种快速扩繁的生产中。就影响牛胚胎移植妊娠率的主要因素进行了分析，以期为牛胚胎移植提供一定参考。

关键词：牛；胚胎移植；妊娠率；因素

中图分类号：S814.4 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）06-0074-04

自Georg首次提出动物胚胎移植概念后，研究胚胎移植技术的历史已经有了120多年。近20多年以来，随着胚胎移植技术中供受体选择、直肠黄体检查、同期、冻精授配、超数排卵、胚胎冷冻保存、胚胎解冻以及胚胎移植等关键环节技术，逐渐被众多畜牧兽医学者和科研技术人员所熟练掌握，特别是研究人员对影响胚胎移植妊娠率的胚胎质量、供受体同期性、受体体况、受体年龄、营养状况、胚胎移植时间、移植部位和环境条件以及移植后受体的饲养管理等诸多因素的不断深入研究。技术被广泛应用于牛、羊等动物的良种快速扩繁的生产中。目前，我国牛胚胎移植妊娠率一般在40%～60%，已达到世界同类高水平。但是，由于供受体不够理想、胚胎价格奇高和胚胎移植产业机制尚未健全以及广大农牧户收入偏低等因素的制约，在胚胎移植大面积推广工作中仍存在较大的难度。

1 胚胎

胚胎质量是胚胎移植妊娠率高低的决定因素。无论是体内胚胎，还是体外胚胎，高质量的胚胎，移植妊娠率就高。但就单一胚胎而言，胚胎的发育阶段或胚胎日龄、胚胎冷冻技术和解冻方法等因素对胚胎移植妊娠率也具有明显的影响。通常情况下，通过超数排卵所获得的体内胚胎的胚龄为6～10日龄。按胚胎的发育阶段，将胚胎可分为桑椹胚（M）、早期囊胚（EB）、囊胚（MB）、扩张囊胚（EXB）和孵化胚胎（HB）[1]。

Hasler等[2]认为牛鲜胚移植时，囊胚的移植妊娠率高于桑椹胚；Thibier等[3]认为囊胚的移植妊娠率与桑椹胚相似；Dochi等[4]认为扩张囊胚的移植妊娠率比桑椹胚低。根据研究资料，一般认为超数排卵供体受精后6～8 d，获得的优质胚胎移植妊娠率差异无统计学意义；但6～8 d的优质胚胎的移植妊娠率显著高于后9～12 d从供体所获得的优质胚胎的妊娠率，其移植妊娠率差异有统计学意义。

Crosier等[5]认为，胚胎质量不同（A级到C级），其移植妊娠率显著不同，早、晚期桑椹胚，和早、晚期囊胚的胚胎质量明显影响胚胎移植妊娠率。Leibo[6]研究发现冻胚移植妊娠率为40%～50%， 冻前A级或B级胚胎解冻后移植率为46%，C级胚胎的移植妊娠率为24%。Broadbent等[7]认为冻胚与鲜胚移植相比，冻胚移植妊娠率低8.5%～14.0%，主要原因是由于冷冻对胚胎物理和化学性损害所引起。胚胎质量、胚胎冷冻和解冻对胚胎的损伤，影响胚胎移植妊娠率。目前最理想的冷冻和解冻方法也将有10%～20%的胚胎受到伤害而死亡，死亡胚胎主要是质量差的胚胎[1]。

体外受精（IVF或IVP）胚移植成功率低于体内胚，但因其生产成本较低，多年来一直是主要的研究方向。由于不同生产方式生产的胚胎，其胚胎质量和发育潜能的不同，移植受胎率也就不同，因此生产高质量的胚胎是提高胚胎移植妊娠率的最有效措施之一[8，9]。

2 供受体同期性

由于受精卵（胚胎）在子宫环境中生长发育，其子宫内分泌发生变化直接影响着子宫内环境的变化，所以供体和受体在生理上的是否同一性直接影响着胚移妊娠率。胚胎移植某一发育阶段的胚胎在供体子宫所处的生理环境或早或迟于移植受体的子宫生理环境，必然影响移植胚胎的着床，所以供体与受体的的同期化就影响着移植妊娠率。

研究发现，当受体比供体早36 h时，胚胎移植妊娠率不受影响，原因目前尚不清楚，可能是由于超数排卵牛的胚胎发育比不超数排卵牛相对快所致[2]。当受体比供体晚12 h以上时，胚胎移植妊娠率就下降[10]。水牛在胚胎移植中，受体比供体晚不到12 h时胚胎移植妊娠率为41%，相差12 h时胚胎移植妊娠率为18%，受体比供体晚的时间超过12 h时，胚胎不能着床[11]。

将质量较差的胚胎移植到同期程度最佳的受体，将质量好的胚胎移植到同期程度较差的受体内，胚胎移植妊娠率最高[12]。将高质量的胚胎移植到同期或比供体早的受体中时，妊娠率差异无统计学意义，两者都高于比供体晚的受体移植妊娠率[11]。质量较差的胚胎移植到比供体早的受体中时，胚胎移植妊娠率低于与供体同期的受体，但当移植到比供体晚的受体时，胚胎移植妊娠率与前者没有差异[1]。由于质量较差的胚胎往往出现发育迟缓，可能移植到比供体晚的受体时，受体为胚胎提供了良好的子宫环境的缘故。所以，开展胚胎移植要充分考虑供、受体的同期性和胚胎的质量[1]。在进行鲜胚移植时，肉牛比奶牛育成牛对供受体非同期性敏感，但有人认为肉牛、奶牛育成牛对供受体非同期性没有差异[13]。

3 受体

移植胚胎与受体之间无遗传关系，但研究发现受体的年龄、营养状况、同期处理方法、孕酮水平和黄体质量等因素对受体胚胎移植妊娠率有着明显的影响。

3.1 年龄与营养

在农牧区进行移植胚胎，受体选用体况较好、无繁殖疾病、体格健壮、抗病性良好、性格温顺、哺育仔畜能力强的经产土种牛。但年龄过大的受体牛，因繁殖能力降低、生殖器官易出现不易观察到的疾病等问题，对移植效果会有一定的影响。青年牛的胚胎移植效果要好于成年牛，但通过子宫颈的难度要高于经产成年牛；青年牛会因个体差异会出现流产，难产率也较高[14]。对于受体来讲，营养对其繁殖性能都具有慢性和长期性的影响作用。受体牛不但要供给自身的维持需要，还要供给胚胎发育的生长需要，从而就产生了受体营养影响胚胎妊娠率的问题。受体牛短期营养不足，可通过动用自身储备的营养来补充，一般对胚胎移植妊娠率没有影响[15]，如果其他营养不充分时，矿物质、微量元素和维生素显得特别重要，它将对母体的繁殖产生长远的影响[16]。营养物质的变化会影响瘤胃的发酵，随之影响物质的代谢和内分泌，因此日粮的选择和相对稳定与营养物质的数量和质量对受体来说具有同样重要的作用[17]。研究表明，受体移植前至少6周确定日粮标准，并维持统一标准日粮8周以上，如果日粮必须变化时，也要逐步进行[10]。

3.2 同期方案

Hasler等[2]认为用前列腺素（PG）处理的受体胚胎移植妊娠率高于自然； Looney等[18]认为用前列腺素（PG）处理的受体胚胎移植妊娠率与自然两者之间没有差别；Church等[19]认为前列腺素（PG）处理的胚胎移植妊娠率低于自然。MacMillan等[20]认为孕酮处理可提高受体的同期率，但长时间使用时（>12 d）降低妊娠率。进口的PRID和CIDR以及国产的海棉阴道栓"牛欢"等都是通过阴道缓慢释放孕酮的装置，胚胎移植实践证明，还存在着脱落和对育成牛阴道壁容易损伤和不适等副作用[1]。

不同的同期方案，对受体牛同期率的影响是不同的。即使是同一方案，对不同品种牛的同期率的影响也是不同的。对于同期方案不能照抄照搬，要根据本区域不品种牛的生长特征、体况营养以及农牧户的经济承受能力，通过研究筛选出同期率高、经济成本低、省工省时、便于操作的方案是科学的做法。

3.3 孕酮水平

孕酮是决定子宫生理状态的主要甾类激素之一，是母体建立和维持妊娠所必需的物质[15]。牛妊娠时外周血液中孕酮的适宜含量为2.0～5.0 ng/mL， 最低限为

3.4 黄体质量

Hasler等[2]认为胚胎移植妊娠率与黄体的质量无关，充满液体的黄体可能是黄体囊肿或早期胚胎死亡的一个可能的原因[23]，后来研究没有发现充满液体的黄体和无液体的黄体牛妊娠率的差异[22]。另外，在受体外周血液孕酮含量方面也没有差异。通过超声波技术观察黄体的大小也没有发现多大的黄体是受体牛妊娠率下降的界限[24]。

4 技术操作

胚胎移植技术操作对移植妊娠率的影响主要表现为操作人员的技术熟练程度、胚胎解冻与脱除防冻剂的方法、通过子宫颈的技巧、胚胎移植所用的时间、移植部位等。理论上认为，将胚胎移植于有孕向发育子宫的任何一侧均能正常妊娠，但是由于受黄体激素分泌因素的影响，以黄体侧移植时能获得较高的妊娠率。胚胎移植器无损伤的顺利通过子宫颈，移植妊娠率一般均较高[25]。但对于因子宫畸形或器质性原因造成的子宫颈难以通过的受体牛，即使通过器械扩张免强通过，也会因出血以及牛体应激过大等因素的影响，很难取得理想的妊娠效果。早期手术移植时，一般很容易将胚胎移植于子宫角深部甚至尖端，而非手术移植时也同样是移植位置越深越能得到较好的妊娠率。但是由于受到移植人员自身素质等因素的限制，若勉强移植于子宫角深部，势必会损伤子宫黏膜，其最终的结果可能会因胚胎被血液凝固或移植时间过长等造成妊娠率更低。生产中，熟练技术人员移植受胎率可高达78.4%[26]。

罗明玖等[27]认为胚胎移植人员移植手法要稳、轻、快，可使子宫颈受刺激尽可能减少，同时防止子宫平滑肌产生不利的逆蠕动，进而影响体内生殖激素的变化，引起不适宜怀孕的反应。李树静等[28]、马群山等[29]还认为手法的轻柔对子宫颈、子宫会造成损伤，一旦内膜损伤，上皮细胞就会脱落，甚至有出血发生，上皮细胞、红细胞、白细胞等进入宫腔，反射性引起子宫自净功能活动将会增强，使胚胎会同组织碎片、各种细胞等一起被排除子宫进入到宫腔内的血液中，由于血液的活性作用对胚胎造成毒害，因而受胎率就大大降低。马群山等[29]、Hillier等[30]等认为若将胚胎自液氮中取出后，直接放入35～38℃的恒温水浴中进行解冻，胚胎易出现透明带破裂现象。在放入水浴中前要在室温中停留3～4 s，效果较好。何光中等[31]报道左侧、右侧卵巢的黄体移植妊娠率有差异，右侧大于左侧，但差异无统计学意义。而付静涛[32]报道左侧黄体受胎率高于右侧，差异有统计学意义。张震等[26]认为胚胎移植所用时间长短也是影响妊娠率的一个关键因素。特别是冷冻胚胎的移植，操作时间长则妊娠率下降，短则有利于提高妊娠率。新鲜胚在1～2 h（保存在37 ℃恒温环境下）内移植，冻胚在5～7 min以内移植，均能够取得较为良好的妊娠率[33]。因此，在非手术移植时，在短的时间内，迅速、熟练、轻巧地将胚胎移植到子宫角的中间位置，也是提高妊娠率的措施之一。同样，在胚胎移植工作中除需熟练进行胚胎室内操作的专业人员外，也不可缺少的需要掌握过硬本领的胚胎移植技术人员（或人工授精技术人员）[34]。

5 饲养管理

移植后受体牛的饲养管理对胚胎移植成功率的特殊作用的研究很少见报道。但从胚胎移植工作的整体来看，胚胎移植前期各项工作的成功仅是完成了胚胎移植的一部分，而移植后受体牛的饲养管理工作绝不能忽视。李树静等[35]在大型奶牛场用黑白花奶牛做受体，移植妊娠率显著高于草原放牧条件下受体牛的移植妊娠率。该研究表明，胚胎移植后受体牛饲养管理水平的好坏，也对移植妊娠率有影响作用。胚胎移植受体牛饲养管理经验表明，在胚胎着床前期，要更加重视和加强受体牛的饲养管理，特别要注意不能饲喂发霉变性、有毒的饲料，也不能饮用冰冷的水；移植胚胎后要适时检查妊娠情况，并及时剔除未妊娠牛群，尽可能将受体牛与育成牛分开饲喂，避免不必要的相互爬跨，防止各种意外造成受体牛的流产。

6 气候因素

气候是一个宽泛的综合因素，以温度的高低、天气的冷暖、大气的干湿等特征来表现。它对胚胎移植妊娠率的影响，是通过气候环境变化影响胚移受体牛所处环境（或其他因素）因素的变化，对受体牛产生的应激刺激而作用的。

环境高温导致母牛乏情或不排卵和妊娠率降低[35]。殷宗俊等[36]认为胚胎移植选在每年的春季和秋季为最好，在这两个时期来自外界的各种强应激因素较少，气候适宜，牛群饲料来源广泛，营养有利于调控，各方面因素都有利于妊娠率的提高。马群山等[29]研究认为因解冻后的胚胎一般要在现场进行移植，而我国北方地区10月末到4月末气温较低，15 ℃以下的温度，将对胚胎造成低温打击，在7～8月份气温较高，母牛的代谢等发生变化，胚胎移植的死亡率相应增加，在我国北方地区最适宜进行胚胎移植的季节为5～6月和9～10月份[29]。

7 其他因素

胚胎移植时所用的仪器设备、通过受体牛子宫的难易程度、受体牛耐受各种刺激的敏感性以及供选择受体数量的多少等人们难以考虑其他因素也会影响胚胎移植妊娠率，只不过每一因素影响的程度不同而已。

综上所述，牛胚胎移植妊娠率的高低受多种因素的影响，在生产中要全面综合考虑各种影响因素，按胚胎移植规程仔细操作，才能获得比较满意的结果。

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