食品安全性指标与菌落总数的测定

摘 要： 菌落总数的测定是食品卫生检验的一个重要指标，本文综述了菌落总数测定常用的方法：国标法、阻抗法、ATP生物发光技术、滤膜法、流式细胞技术等，简要展望了该领域未来的发展。

关键词： 菌落总数 检测技术 食品

菌落指的是生长在固体培养基上，通常由一个细胞生长繁殖而成的肉眼可见的微生物细胞群体。菌落总数作为食品安全的重要卫生指标，反映食品被污染的程度。食品生产、运输、消费过程中的微生物污染造成的食源性疾病是世界安全中最突出的问题。GB/T4789.2中规定的菌落总数是指食品检样经过处理后，在一定条件下培养（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1 mL（或1g）检样中形成的菌落总数。该规定中的“一定时间”通常指48h～72h培养基中长出的菌落，这一时间段只有细菌能够长成菌落，菌落总数即活的细菌数，且不包括嗜冷菌、嗜热菌、厌氧菌等特殊环境条件下生长的菌。目前，检验机构对食品中菌落总数的测定通常选择国标法，但因国标法的检测周期较长，影响产品的新鲜度和货架期，快速检测技术应运而生且发展迅速。

1.国标法

GB/T4789.2规定菌落总数的测定方法有两种：平板菌落计数法和菌落总数PetrifilmTM测试片法。平板菌落计数法包括采样、稀释、培养、计数等步骤，过程繁杂，需要一定的专业操作技能。平皿长出的菌落有的比较小，有的颜色与培养基相近或相同，在计数过程中不容易区别，因此在实际工作中常常将TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）加入到培养基中。TTC是脂溶性的光敏感复合物，能被活细胞还原为红色，使培养基中的菌落呈红色，便于计数。

菌落总数PetrifilmTM测试片法是将菌液滴至含培养基和指示剂的纸片上进行培养，纸片由灭菌滤纸、纤维膜、胶膜等作为载体，省略了培养基配制、消毒灭菌等过程。近年来的研究报道称美国3M公司生产的PetrifilmTM效果好。

2.阻抗法

阻抗法是利用菌体代谢过程中能将培养基中的蛋白质、脂类、糖类等电惰性物质分解为小分子的胺类、有机酸、无机盐等有电活性的物质，在溶液两端通以小振幅交流电，通过测定一定时间内阻抗参数值的变化，快速、定量分析样品中的微生物变化情况，阻抗值与微生物污染程度存在相关关系，样品中微生物污染程度高，则阻抗参数变化较大，建立阻抗值与菌落总数之间的标准曲线，通过测定食品的阻抗值，计算出食品中含有的菌落总数。阻抗法比传统的平板计数法更快速，能够动态地对菌落总数进行实时监控，操作简单，灵敏度高。其缺点是投资高，对好盐微生物难以检测。

3.ATP生物发光技术

ATP生物发光测定法是一种快速检测菌落总数的方法，是基于萤火虫发光机理设计的。活菌中含有ATP且其含量固定，菌体死亡后，ATP将很快被菌体中的酶分解，研究表明，ATP生物发光反应的发光强度与ATP含量呈正比，ATP生物发光法是通过提取菌体的ATP，测定ATP浓度，从而推算出样品中的活菌数。反应机理：以荧光素、ATP、氧气为底物，在虫荧光素酶的催化下，荧光素分子被激活，其电子跃迁到不稳定的高能态，当电子回到低能态时发出荧光光子，荧光素不断被激活，连续产生荧光。ATP生物发光法的优点是快速、简便、灵敏度高，其检测过程仅需要数分钟，其缺点是不能区分非菌体ATP，会干扰结果。另外，ATP的提取方法也会造成干扰和抑制发光作用。

4.滤膜法

滤膜法又称膜过滤法，原理：待检检样通过已灭菌的滤膜，经过抽滤，菌体被留在滤膜上，然后将膜贴于选择性培养基上进行培养，根据长出的菌落数即可推算出检样中的微生物数量。此方法投资小，但仅适用于液体或气体，且含微生物数量较小的样品，不适用于含有直径大于滤膜孔径的颗粒状样品。滤膜法通常用于饮料或水中菌落总数的测定，若用于固体或直径大于滤膜孔径的颗粒状样品，则需用无菌水浸提样品，取上清液通过滤膜过滤。

5.流式细胞技术

流式细胞技术以流式细胞仪为工具，其检测原理是样品经试剂处理时，只对样品中存在的活菌进行荧光标记。这些试剂基于一种非荧光底物，这种底物在酶的作用下可与活细胞结合，生成荧光标记细胞，并进行富集。标记后的微生物细胞被注射进ALS仪器内的一条石英流式细胞柱，形成一条狭窄的分析流，确保微生物单个接连通过激光激发柱，激活激发荧光标记细胞发出荧光，每个细胞形成的荧光信号由灵敏的检测器收集并由数字处理器分析，得出样品中的菌数。对食品中的活菌数直接进行检测，速度快，无需增菌，可在90～100 min内出具检测结果，灵敏度高。

食品卫生与人类健康关系密切，菌落总数的检测是食品卫生程度的重要指标。随着微生物检测技术及相关学科的发展，产生了很多关于菌落总数测定的新方法、新技术、新仪器，国家标准测定方法目前仍是菌落总数测定的主要方法。除上述列举的方法外，还有定量PCR法、显微图像识别技术、放射测量法、固相细胞计数法等，各种方法都有优势，但在研究过程中也暴露出一些不足，是科研人员努力的方向。