乳腺癌血清蛋白质谱在手术前后变化分析

摘要：目的： 应用表面加强激光解析电离化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术分析乳腺癌病人手术前后血清蛋白质谱的变化。方法： 应用SELDI技术（CM10芯片），检测65例行改良根治术的乳腺癌病人手术前、术后7天以及术后1月血清蛋白质谱并分析其差异。结果： 共发现11个蛋白质峰与正常女性存在差异， 5个术前增高的蛋白质峰中有4个在术后1月降至对照水平，6个术前降低的蛋白质峰在术后7天及术后1月均低于健康对照峰值水平。结论： 乳腺癌相关蛋白峰在术后的动态变化可能成为评价手术疗效预测的参考指标，同时在乳腺癌术后复发转移监测等方面有一定的意义。

关键词：表面加强激光解析电离化飞行时间质谱 乳腺癌

乳腺癌是一种全身性疾病，主要治疗手段有化疗、手术、放疗及内分泌治疗等，其中手术是乳腺癌综合治疗的重要组成部分。部分乳腺癌病人经过手术及后续的综合治疗能够长期存活，但也有病人术后很快出现复发转移，而一旦复发转移，乳腺癌就成为不可治愈的疾病。因此，早期发现复发转移就成为治疗的关键，目前临床上主要依靠定期随访影像学（包括彩超、钼靶、CT、ECT、PET/CT等） 以及血清学指标（如CEA和CA153），但影像学存在难以发现小病灶（1cm以下）、费用较高、存在辐射等缺陷，血清学标志物也存在敏感性、特异性较差的缺点[1]。由于恶性肿瘤的发生是一个逐步的过程，可能发生一系列蛋白组学的改变，因此，通过近年出现的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）蛋白组学技术，能够快速、敏感地在血清中同时筛选出多个的未知生物标记物，其检测肿瘤的敏感性和特异性均高于传统肿瘤标志物[2]，因此，我们应用SELDI技术分析乳腺癌病人手术前后的血清蛋白质谱变化，以期发现其变化规律。

1.资料与方法

1.1临床资料：收集我院2013年1月-2013年10月经病理确诊的65例女性乳腺癌病人手术前后的血清标本，中位年龄47岁，其中Ⅰ期18例， Ⅱ期19例，Ⅲ期28例。

1.2. 主要仪器及试剂：ProteinChip Biology System质谱仪（PBSⅡ-C型）、CM10蛋白质芯片、BioMarker Wizard分析软件，三氟乙酸（ TFA ） 、乙腈（ACN ） 、Tris-HCl 、能量吸收分子SPA等试剂（Sigma公司）。

1.3. 样品的处理：采集患者清晨空腹静脉血5ml，4℃静置1小时后再分离血清，分装后- 80℃保存。分析前将- 80℃保存的血清标本冰浴中解冻，10000rpm、4℃离心5min，取10μl与20μlU9缓冲液在EP管中充分混匀，冰浴振荡30min使蛋白质充分变性，将360μl CM10-buffer加入30μl上述变性后的样品，尽快混匀。

1.4. 芯片监测、数据采集和参数设置：经芯片处理、上样和洗脱步骤后，采用PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读仪读取芯片，收集数据采用Ciphergen ProteinChip软件，分析数据采用BioMarker Wizard软件。控制筛选出的蛋白质峰在10%以上样本中同时存在，且同一蛋白质峰在不同样本中的偏差

1.5 统计分析：所得数据以均数±标准差表示，对不同组中相同质荷比的蛋白质含量数据进行方差分析，P

2 结果

2.1乳腺癌病人手术前、术后7天以及术后1月血清蛋白质谱比较.我们随访收集了65例行改良根治术的乳腺癌病人手术前、术后7天以及术后1月的外周血血清，并分别检测其差异蛋白质谱。共筛选出11个差异蛋白质峰，其中术前高于正常女性的差异蛋白质峰有5个（2947、3272、7783、7985、15952 Da），术前低于正常女性的差异蛋白质峰有6个（4179、5642、6442、6639、8705、13771 Da），其变化结果见表1及图1、2。

表1 乳腺癌病人手术前、术后7天以及术后1月血清蛋白质谱差异蛋白质峰

P

图1. 术前增高的5个蛋白质峰（Da均值）在术后的变化及与健康对照的比较

图2. 术前降低的6个蛋白质峰（Da均值）在术后的变化及与健康对照的比较

2.2乳腺癌病人手术前后血清蛋白质谱差异蛋白质峰变化趋势分析

进一步分析表明，术前增高的5个蛋白质峰中有4个蛋白质峰（2947、3272、7985、15952 Da）在术后1个月的峰值有向正常峰值变化的趋势，而其中的7985、15952 Da两个峰值虽然在术后7天较术前有明显增高（P

3 讨论

中国是乳腺癌发病率增长速度最快的国家之一，近年来乳腺癌发病率正以每年3%的速度递增，乳腺癌目前已成为威胁我国女性健康的一大杀手，早期乳腺癌有治愈的可能，但乳腺癌一旦发生复发转移，将不可治愈[3]。因此，如何在手术后及时、尽早发现微小或潜伏的转移灶是乳腺癌是否可以治愈的关键。目前乳腺癌缺乏有效的监测复发手段。影像学检查常用于定期随访，但影像学检查对

SELDI技术通过寻找和筛选不同样本之间蛋白质谱存的差异，从而获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，又称差异蛋白组学[5]。我们采用的CM10芯片表面由弱羧基阴离子构成，可捕获表面带有正电荷的蛋白质分子[6]，通过洗去弱结合蛋白质，再结合上能量吸收分子（EAM），利用激光脉冲使吸附的蛋白质解析形成电荷离子，这些不同的荷质比的离子在真空电场中飞行时间不同，检测器就能接收到强弱不等的电信号并由此绘制出蛋白质的飞行质谱图，其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。因此SELDI技术能分析血清中蛋白质较完整的信息，在寻找肿瘤相关生物标志物方面具有优势，Li等应用SELDI技术分析了包括103例乳腺癌、25例乳腺良性病变及41例健康女性的血清标本，建立了由3个蛋白峰组成的诊断模型，诊断乳腺癌灵敏度为93%，特异度为91%。我们前面进行的研究也发现，蛋白质峰15952 Da在乳腺癌与健康女性、乳腺癌与乳腺良性肿瘤比较中有差异，而蛋白质峰7985 Da在乳腺癌、乳腺良性肿瘤与健康女性三组比较中差异均有差异。

为了寻找乳腺癌手术前后血清蛋白质谱的差异，观察乳腺癌血清蛋白质峰在手术治疗前后的动态变化，我们随访收集了33例行改良根治术的乳腺癌病人手术前、术后7天以及术后1月血清蛋白质谱，综合后总结发现术前有11个蛋白质峰的峰值与健康对照峰值存在差异（5个高于正常，6个低于正常），他们均有可能是乳腺癌相关的血清标志物，变化趋势有可能与预测复发转移有关。

我们研究结果显示5个术前增高的乳腺癌相关蛋白质峰的大部分（有4个，分别为2947、3272、7985、15952 Da）在术后1个月的时候与健康对照女性差异无统计学意义，即降至正常水平，提示它们的水平可能与肿瘤负荷的大小有关，随着术后肿瘤负荷的明显减小，这些峰值也向正常水平趋近。虽然其中的两个蛋白质峰（7985、15952 Da）在术后7天的时候较术前有明显增高，但在术后1个月仍可恢复到接近健康对照水平，术后7天的这两个蛋白质峰的增高可能与手术改变解剖结构使这些蛋白释放入血有关，需进一步研究及扩大病例数。结果还显示并非所有术前增高的乳腺癌相关蛋白峰在术后均恢复到接近正常水平，如蛋白质峰7783 Da在术后7天及术后1月均持续高于正常水平。另外，术前降低的6个乳腺癌相关蛋白峰在术后7天及1月也低于正常峰值，也就是说，局部手术治疗并不影响这部分蛋白质峰的峰值，这可能是由于乳腺癌是一种全身性疾病，局部手术切除肿块并不能杀灭其他部位的隐匿病灶有关，还需要进一步的研究。

综上，根据乳腺癌病人手术前后血清蛋白质谱SELDI分析结果，我们发现了一些乳腺癌相关蛋白峰在术后的动态变化规律，我们希望随着样本量的扩大，随访时间的延长，收集到更多这些病人发生复发转移时的血清样本进行SELDI检测以进一步分析，以期在乳腺癌术后复发转移监测方面提供新的思路。

参考文献：

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[2] Schuhmacher M，Xifro A，Liobet JM，et a1.Analysis of Proteomics Spectra in Serum from Patients with Breast Cancer by SELDI-TOF Mass Spectrometry[J]. JOURNAL OF HENAN UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY （MEDICAL SCIENCE）， 2010，28（4）：253-255.

[3] Mitov FS， Molov VV. Breast-conserving surgery in early-stage breast cancer （indications， local recurrences， survival， cosmetic results）. Folia Med （Plovdiv） JT - Folia medica， 2006，48（1）：23-30.

[4] 李克，曹璐颖. 血清蛋白质组学技术在肿瘤血清标志物筛选中的应用[J]. 医学研究杂志，2012，41（9）：18-21.

[5] 尚京川，易发平，吴民军，等. 蛋白质组学技术筛选肝癌血浆/血清中的差异蛋白质[J].重庆医科大学学报，2010，35 （8）：1212 -1216.

[6] 黄欣，徐雅莉，彭理，等. 利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱联合磁珠技术寻找乳腺癌血清蛋白标志物[J].中华乳腺病杂志（电子版），2012，06（2）：125-137.