快速康复外科联合四君子汤对急性胆道梗阻大鼠肝脏缺血―再灌注损伤时肝细胞凋亡的影响

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.06.013

基金项目：浙江省教育厅科研项目 （Y201120554）

作者单位： 310006 杭州， 浙江中医药大学附属第一医院外科

通信作者： 傅永清，Email：

急性梗阻性黄疸患者手术中发生的肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury， HIRI）是导致患者术后肝功能衰竭的主要原因。HIRI发生机制复杂，目前已知与细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等有关[1]。当前，尚无防治HIRI的有效治疗措施 [2]。快速康复外科（fast-track surgery，FTS）的核心观念是利用术前、术中、术后的综合性措施减少机体应激反应，减少创伤，促进早期康复。其主要措施包括术前不禁食、禁饮，不作机械肠道准备，术中不留置引流，术后早期进食，取消不必要的胃肠减压等与以往传统习惯不同的围手术期处理方式。本研究以FTS联合中药四君子汤作为干预手段，从抗细胞凋亡的角度研究其对急性梗阻性黄疸大鼠HIRI的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康SD大鼠80只，雄性，体质量（220±40）g。随机（随机数字法）分为4组：1个对照组、3个实验组（FTS组、四君子汤组、FTS+四君子汤组），每组各20只。

四君子汤（人参12 g、茯苓9 g、白术9 g、炙甘草6 g）：上方水煎煮2次，合并滤液浓缩至生药质量浓度为1 g/mL；细胞凋亡检测试剂盒：美国罗氏公司。鼠抗人Bcl-2，Bax单克隆抗体：美国Santa Cmz公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型及手术方法 制备模型方法如下。每100 g体质量0.13 mL 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，距肝门0.5 cm处用4-0丝线结扎胆总管后关腹（图1）。术后第4天，第二次手术（肝脏缺血-再灌注）。开腹后，分离肝蒂，用5-0血管缝线结扎门静脉，持续缺血40 min，开放门静脉予再灌注，关腹（图2）。

图1 胆总管结扎 图2 门静脉结扎

1.2.2 分组干预方法 常规围手术期处理措施：术前禁食、禁水12 h；术前生理盐水灌肠1次；术中放置腹腔引流管；术后禁食6 h。①对照组：实施常规围手术期处理；②四君子汤组：实施常规围手术期处理，胆总管结扎后至缺血-再灌注手术前予四君子汤灌胃3 d，每次2 mL，每天1次；③FTS组：不实施常规围手术期处理（术前开放饮食、饮水，不灌肠，不放置引流管，术后不禁食）；④FTS+四君子汤组：不实施常规围手术期处理（术前、术后均不禁食，不灌肠，不放置引流管），胆总管结扎后至缺血-再灌注手术前予四君子汤灌胃3 d，每次2 mL，每天1次。

1.2.3 标本采集及检测 缺血-再灌注术后24 h，心脏取血，打开腹腔，剪取肝脏组织约10 g检测。 血清，检测AST、ALT水平。 TUNEL法检测肝细胞原位凋亡，操作方法按试剂盒说明进行。判断标准：以光镜下观察到胞核呈棕色或棕褐色为原位凋亡细胞。计算凋亡指数（apoptosis index，AI）：光镜下随机选取5个视野，计数平均200个细胞中的阳性细胞数，以百分数表示。 采用免疫组化二步法染色检测肝细胞Bcl-2，Bax蛋白表达。阳性结果判断标准：胞浆出现黄色或棕黄色着色为表达阳性。每张切片随机选择10个高倍视野（×400），测平均光密度（OD），以平均光密度作为指标进行半定量分析。

1.3 统计学方法

计量资料用均数±标准差（x±s）表示。各组均数比较采用单因素方差分析。使用SPSS 20.0软件包，以P

2 结果

动物总共死亡7只，病死率8.75%。其中胆总管结扎术后至缺血-再灌注手术前死亡5只（6.25%），缺血-再灌注术后死亡2只（2.5%）。

2.1 血清ALT、AST水平

3个实验组ALT及AST水平均较对照组显著降低（P

2.2 肝细胞原位凋亡及凋亡指数

3个实验组肝细胞凋亡指数均显著低于对照组，P0.05。见表2。

2.3 Bcl-2、Bax蛋白表达情况

3个实验组Bcl-2蛋白表达均显著高于对照组，而Bax蛋白表达均显著低于对照组（P

A：对照组 Bax；B：对照组Bcl-2；C：FTS组 Bax；D：FTS组 Bcl-2 ；E：四君子汤组 Bax ；F：四君子汤组 Bcl-2 ；G：FTS+四君子汤组 Bax ；H：FTS+四君子汤组Bcl-2

图2 三组大鼠的Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达（ ×200）

3 讨论

缺血-再灌注损伤的机制错综复杂，其中细胞凋亡、氧化应激、炎症反应这些致损伤机制相互交错影响[3-4]。本研究选取FTS和中药四君子汤作为干预措施。根据FTS理念，已发展出多项贯穿整个围手术期的具体措施，术前：不禁食禁饮，避免机械肠道准备；术中：控制体温，控制液体量，避免不必要的引流；术后：早期饮食，早期拔除胃管、导尿管等。临床研究已证明应用FTS较传统围手术期处理具有更好的康复疗效[5-6]。本研究中另一干预措施为中药四君子汤。四君子汤出自《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、炙甘草组成，具有健脾益气的功效。研究证明四君子汤具有抗氧化作用[7]，对肠黏膜缺血-再灌注、脑组织缺血-再灌注及心肌缺血-再灌注等急性损伤有很好的保护作用[8-10]。

本研究结果表明，单独运用FTS或四君子汤均可显著降低HIRI时血清ALT、AST水平，联合运用FTS+四君子汤时降低ALT效果较单独运用更好，而降低AST的效果则与单用四君子汤相似，较单用FTS强。可见两种措施均有明显降酶效果，其中以四君子汤降酶效果较强，联合运用两者是更理想的选择。Bcl-2是目前发现的最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因。实验表明，Bcl-2可能作用于细胞凋亡的最后共同途径，即阻止DNA损伤后激活凋亡机制的信号到达它的靶位，从而中断凋亡感应子和效应子阶段的联系[11]。Bax在高浓度时本身可启动细胞死亡，低浓度时可使细胞器释放出某些分子，引起半胱氨酸蛋白酶（caspase）的活化，并拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。已有研究表明Bcl-2/Bax比例失调可能是缺血-再灌注损伤时肝细胞发生凋亡的重要原因之一，当比例增大时凋亡受抑制，比例减小时凋亡活跃。本研究发现FTS组、四君子汤组、FTS+四君子汤组肝细胞凋亡指数均较对照组明显降低。进一步研究发现Bcl-2表达在对照组、FTS组或四君子汤、FTS+四君子汤组中呈逐渐增高趋势，Bax表达则呈逐渐降低趋势。运用FTS或四君子汤作为干预措施使HIRI时肝细胞凋亡受到明显抑制，其机制与上调肝细胞Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，使Bcl-2/Bax比值增大有关。

参考文献

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（收稿日期：2014-01-04）

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