酵母提取物诱导欧洲花楸悬浮细胞合成次生代谢产物的机制探究

[摘要] 以欧洲花楸悬浮培养细胞（SASC）为材料，检测酵母提取物（YE）处理后SASC生理生化指标的变化，初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制。结果表明： YE诱导SASC合成了5种联苯类化合物，且5种化合物含量随诱导时间的延长呈现不同的变化规律；YE处理抑制细胞的生长；细胞培养液中的pH随着处理时间的延长逐渐降低；细胞中的可溶性蛋白质含量表现为缓慢下降的变化趋势，YE处理组（YE组）可溶性蛋白质含量与对照组（CK组）相比显著增加，最高时相对增量达到了147.76%；CK组和YE组细胞外Ca2+都表现为内流，但YE组的内流明显小于CK组。 说明YE诱导使细胞处于一种胁迫状态，不利于细胞的生长，迫使细胞合成了联苯类化合物抵御外界胁迫；细胞内可溶性蛋白可能作为酶类参与调控化合物的合成；Ca2+信号分子可能介导细胞应对YE胁迫的信号转导。

[关键词] 欧洲花楸悬浮细胞；酵母提取物；次生代谢产物；机制

[收稿日期] 2013-12-20

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81130070，81072989）； 国家科技支撑计划项目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] 郭兰萍，Tel：（010） 64011944，E-mail： glp01@126. com

[作者简介] 黄蕾，E-mail：

欧洲花楸Sorbus aucuparia L.为蔷薇科苹果亚科花楸属落叶乔木或小乔木，原产欧洲和亚洲西部温带高山区域[1]，其干燥成熟果实可食用和入药[2]。我国花楸属植物50余种，资源丰富，供药用者约6种[2]。目前研究发现，苹果亚科植物受到外界病原菌侵害时特异性地产生联苯类化合物作为植保素[3]，Kokubun T等使用铜离子处理欧洲花楸叶片后，可以从叶片中分离出欧花楸素[4]，这种联苯类化合物在健康的植株中并不存在，且其具有广泛的生物活性。欧洲花楸是集药用、食用、园林和生态价值于一身的珍贵树种。

欧洲花楸悬浮细胞（SASC）生长速度快、周期短，可作为很好的研究材料[5]，已有研究发现用酵母提取物（YE）作为诱导子处理可使SASC迅速合成联苯类化合物[6]。但是，目前这类具有植保素作用的化合物合成机制尚不明确，还有待进一步的研究。

本实验以SASC为材料，通过检测YE处理后SASC次生代谢产物的变化及其细胞培养液中pH、可溶性蛋白含量、细胞外Ca2+流等生理生化指标的变化，初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制，尤其是从可溶性蛋白和钙离子2个方面为机制研究提供了很好的思路和方向，为更深层次地研究打下基础。

1 材料

欧洲花楸悬浮细胞系由中国科学院植物研究所叶和春研究员赠送。

培养箱（Conviron Adaptis CMP6010）；超大型摇床（ZYSA0351）；电子天平（Sartorius BS 2202S）；超净工作台（SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台）；分析型酸度计（JENWAY3510）；高效液相仪（Waters 2695_2996）；UV检测器（T6新世纪19-1650-01-1169）；液质联用仪（Agilent 6320 Ion Trap）；其他常规设备。

牛血清蛋白为美国MP公司产品；Yeast extract为OXOID公司产品；其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。

2 方法

2.1 细胞悬浮培养体系的建立 诱导出的欧洲花楸愈伤组织接种于含50 mL MS固体培养基的400 mL广口瓶中，愈伤组织每 14 d 继代1次，经过3～5次继代后，选择疏松的愈伤组织转入液体培养基中培养，每 250 mL 三角瓶中分装 50 mL 的液体培养基，置于25 ℃培养箱中暗培养。悬浮细胞培养转速设定为 120 r・min-1。实验中使用的欧洲花楸悬浮细胞是将减压过滤后的 1.4 g细胞接种于含有 20 mL MS液体培养基的100 mL 三角瓶中。

2.2 YE诱导子的配制及处理 用蒸馏水溶解酵母提取物，配制60 g・L-1的母液，高压灭菌。参照Liu B等处理方法[6]，处理终浓度为3 g・L-1。

2.3 欧洲花楸悬浮细胞中次生代谢产物的提取和检测 将收获的细胞用15 mL甲醇在研钵中研碎，使用滤纸和漏斗将滤液过滤到鸡心瓶中，过滤后的细胞残渣再用10 mL甲醇提取1次，合并滤液，将鸡心瓶置于旋转蒸发仪上浓缩至干。培养基用15 mL乙酸乙酯萃取2次，用分液漏斗分离，将乙酸乙酯层倒入提取细胞后的鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上浓缩至干。用1 mL的乙酸乙酯定容。

将提取液中的乙酸乙酯溶液挥干，用500 μL的色谱甲醇溶解，过0.22 μm的有机滤膜后用于HPLC检测。

HPLC测定条件为：液相色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水-甲醇（50∶50）流速0.7 mL・min-1；紫外检测波长为280 nm。

质谱条件为：离子源为ESI；正离子模式；雾化气压力206.85 kPa；干燥气为氮气，干燥气温度300 ℃，流速10 L・min-1；毛细管电压4 000 V；相对分子质量扫描范围100～600；柱尾分流 2∶1。

2.4 欧洲花楸悬浮细胞生物量测定 将培养的悬浮细胞真空抽滤至不滴水后，直接称量细胞鲜重即为生物量，用鲜重（FW）表示，每个处理设置4个生物学重复。

2.5 细胞悬浮液pH测定 采用分析型酸度计直接测定培养基中的pH，每个处理设置4个生物学重复。

2.6 细胞中可溶性蛋白质含量的测定 用考马斯亮蓝G-250法测定[7]，以牛血清蛋白作标准曲线，单位为mg・g-1（鲜重），每个处理设置4个生物学重复。

2.7 细胞外Ca2+流变化的测定 采用非损伤微测技术（NMT）[8]，用多聚赖氨酸玻片固定细胞，加入测试液稳定15 min，在显微镜下找到直径约200 μm的细胞簇，测定时间为10 min，每个处理设置5个生物学重复。

3 结果与分析

3.1 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞次生代谢产物的影响 细胞经YE处理后，在其细胞提取物中检测到5种联苯类化合物，分别推断为2′-OH-aucuparin（1），3，5-dihydroxy-biphenyl（2），noraucuparin（3），aucuparin（4），eriobofuran（5）。随着诱导时间的延长，SASC合成的联苯类化合物总量呈上升趋势，但5种联苯类化合物在细胞中的含量则分别呈现出不同的积累规律见图1。

化合物1在YE诱导24 h后方可检测到，在48 h时该化合物的含量达到峰值，随着诱导时间的延长含量逐渐减少，但是在156 h时，其含量又呈现增加趋势。

化合物2在YE诱导24 h时浓度达到峰值，在其他检测时间点上该化合物的含量都较低。

化合物3是YE诱导后最先检测到的化合物，其含量表现出周期性波动的趋势，12～36 h其含量显著增加，36 h时出现峰值，36～96 h含量又显著下降，108～168 h含量再次缓慢增加。

化合物4含量相对其他化合物较高，在YE诱导24 h之后其含量逐渐增加，132 h含量达到最大值，132～168 h其含量呈现缓慢下降趋势。

YE处理后检测到化合物5的时间最迟，直到36 h该化合物才积累到一定的浓度。随着处理时间的延长，该化合物的含量呈波动性增加的趋势，168 h时其含量达到最大值。

由以上结果可知YE诱导子对SASC合成联苯类化合物的影响是一个动态的变化过程，随着处理时间的变化，SASC合成不同的联苯类化合物的组分及其组分间的配比都发生了改变。

3.2 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞生物量的影响 YE对SASC生物量的影响见图2中的实际值，为了解YE诱导后细胞生物量与CK组的变化，根据已得到的SASC生长曲线的拟合函数：f（x） =0.369 9/[1+10.77 exp（-0.329 2x）][5]。

将取样时间点代入函数，得到了细胞在正常生长条件下生物量的理论值（图2中的理论值），用得到的理论值减去实验中测得的实际值，得到了理论值和实际值之间的差值（图2中的差值）。

在添加YE诱导子后（如图实际值），细胞生物量呈现出缓慢的先增加又减少的过程，其变化幅度并不是很明显。在取样时间段内，细胞生物量变化不大。

分析理论值、实际值之间的差值，说明在YE的影响下，SASC增长曲线偏离了细胞增长模型的曲线，YE对SASC的影响整体表现为抑制作用。随着YE对SASC诱导时间的增加，YE对SASC的抑制作用也逐渐增大。

3.3 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞细胞悬浮液中pH的影响 随着处理时间的增加，细胞悬浮液的pH也越来越小。细胞悬浮液的pH变化大致为2个阶梯式下降，见图3。48 h至108 h，pH缓慢下降，在108 h时降至6.445，至此第1阶段结束；在120 h时细胞悬浮液pH降至6.045，在120 ～168 h，pH处于另一个下降阶段，但下降的幅度较上个阶段要大。

正常细胞培养状态下，细胞悬浮液中的pH随着培养时间的延长而逐渐升高[5]。添加YE后细胞悬浮液pH呈明显下降趋势，说明可能是SASC产生的次生代谢产物导致pH变化，并且这种pH的改变并不利于细胞的生长。

3.4 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞中可溶性蛋白质的影响 CK组细胞中的可溶性蛋白质含量表现为缓慢下降的变化趋势，见图4。在24，48 h时含量最高，随着时间的延长可溶性蛋白质的含量开始下降，在120，144，168 h 3个时间点上，可溶性蛋白质的含量相差无几。YE组SASC中可溶性蛋白质的含量呈现出缓慢下降，再趋于稳定的趋势。24～96 h细胞中的可溶性蛋白质含量逐渐下降，96 h之后细胞中的可溶性蛋白质含量逐渐趋于稳定。

将YE组细胞可溶性蛋白含量与CK组做差，得到YE处理后细胞中可溶性蛋白含量的增量，然后与CK组对比得到细胞内可溶性蛋白质的相对增量，见图5。从图中可清晰得出，YE处理后细胞内可溶性蛋白质含量与CK组对比，主要经历2个阶段，第1个阶段其相对增量大概在50%左右，120 h之后进入第2个阶段，细胞内可溶性蛋白相对增量达到了140%左右。

3.5 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞外Ca2+流的影响 YE对细胞外Ca2+流的影响，YE组与CK组细胞外Ca2+都表现为内流现象，但是YE组Ca2+流平均值显著小于CK组。从动态流速图中也可以得出，虽然YE组与CK组都是在测定初期Ca2+内流速度较大，随着测定时间的延长速度逐渐减小，但YE组速度始终小于CK组。说明YE处理后导致细胞外Ca2+内流大量减少，见图6。

4 讨论

YE处理后SASC提取物中检测到5种联苯类化合物，而正常培养条件下细胞并没有合成这类化合物，说明细胞合成这类化合物来应对YE诱导子的胁迫。同时，随着处理时间的延长细胞培养液中的pH逐渐降低，细胞生物量与CK组比增长明显缓慢，说明SASC在YE胁迫下合成的次生代谢产物可能改变了培养液中的pH，导致了细胞的生长条件恶化、影响细胞膜的通透性，使细胞不能正常进行生长、分化、增殖等生命活动，最终导致细胞的生物量下降。

有研究推测联苯类化合物合成过程中有一定的转化顺序[9] ，本研究发现5种联苯类化合物含量随着处理时间的延长呈现不同的积累规律，整体表现为：1，2，3号化合物处理后12 h即可用现有方法检测到但相对含量较低，并且积累量迅速达到峰值然后下降，推断这3种化合物可能是联苯类化合物生物合成途径上的上游化合物或中间体；4，5化合物积累时间相对较晚，且呈较小波动的稳定积累状态，其可能处于合成途径的下游，结构相对稳定。本研究在一定程度上明确了联苯类化合物之间存在的转化，为明确转化顺序提供了依据。

YE组细胞中可溶性蛋白质的含量与CK组对比具有显著性差异，在YE诱导下，可溶性蛋白质的相对含量越来越大，最高时相对增量达到了147.76%，说明细胞为了抵抗真菌带来的伤害，对防治机制的投入也越来越多，多合成的可溶性蛋白质可能是初生生长所不需要的，用来调节催化次生代谢产物的合成。

本实验研究发现YE处理后SASC细胞外Ca2+内流与CK组对比显著减少，说明在细胞受到YE诱导子胁迫后，Ca2+作为信号分子可能介导细胞合成次生代谢产物的信号转导。

本实验通过分析生物量、细胞培养液中的pH以及细胞内可溶性蛋白含量的变化，发现YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制与道地药材形成的逆境效应的假说[10]基本一致。在不受外界环境胁迫的情况下，植物首先满足的是生长和繁殖；在面对不同因素的胁迫时，植物会合成次生代谢产物抵御外界不利环境，为此需要付出相应的成本，因而会降低植物的初生生长速度。此外，细胞应对YE胁迫迅速启动了Ca2+信号分子，说明Ca2+可能介导SASC合成次生代谢产物的信号转导。这些为YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制研究拓展了思路，为下一步深层次的研究打下了坚实基础。

[参考文献]

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[8] 印莉萍， 上官宇， 许越. 非损伤性扫描离子选择电极技术及其在高等植物研究中的应用[J]. 自然科学进展， 2006， 16（3）：262.

[9] Hüttner C， Beuerle T， Beerhues L， et al. Differential effect of elicitors on biphenyl and dibenzofuran formation in Sorbus aucuparia cell cultures[J]. J Agric Food Chem， 2010， 58（22）：11977.

[10] 黄璐琦， 郭兰萍. 环境胁迫下次生代谢产物的积累及对道地药材形成的影响[J]. 中国中药杂志， 2007， 32（4）：277.

Mechanism exploration on synthesis of secondary metabolites in

Sorbus aucuparia cell cultures treated with yeast extract

HUANG Lei， XIAO Wen-juan， YANG Guang， MO Ge， LIN Shu-fang， WU Zhi-gang， GUO Lan-ping

（State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Suspension cultures cell of Sorbus aucuparia （SASC） was used as materials， the changes of physiological and biochemical indexes of SASC after treatment with yeast extract （YE） were detected， and the synthetic mechanism of secondary metabolites in SASC treated with YE was preliminarily explored. The results were as follows： under the assay conditions， SASC was induced to synthesize five biphenyl compounds， and these compounds content changed differently with induction time prolonging； YE treatment inhibited cell growth， the culture medium pH was gradually reduced after treatment； water-soluble protein content showed a trend of slow decline， which was significantly increased in YE treatment group （YE group） compared with the control group （CK group）， the maximum relative content was 147.76% in contrast with CK group； both YE group and CK group were extracellular Ca2+ flow influx， but the YE group flow was significantly slow than CK group. The results indicate that YE induced the cells in a stress state， which was not conducive to the growth of cells and forced the cells to synthesize biphenyl compounds against external stress； water-soluble protein may serve as intracellular enzymes involved in the synthesis of compounds regulation； Ca2+ may as signal molecule mediate cell signal transduction respond to YE stress.

[Key words] suspension cultures cell of Sorbus aucuparia； yeast extract； secondary metabolites； mechanism

doi：10.4268/cjcmm20141114