干细胞在肝硬化门脉高压治疗中应用的研究进展

摘要：肝硬化在我国的发病率较高，其治疗效果欠佳，失代偿期肝硬化临床缺乏特异的治疗方案，患者多死于并发症。近年来对肝干细胞的研究为治疗肝硬化门脉高压症提供了新思路。随着对干细胞研究的深入，有望实现肝病细胞治疗的新突破。本文就干细胞的分类、来源及在肝硬化门脉高压中的应用做一综述。

关键词：干细胞肝硬化门脉高压移植

【中图分类号】R-0【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2012）12-0029-02

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，目前临床上仍缺乏失代偿期肝硬化特异性的治疗方法，主要是给予对症支持治疗，多数失代偿期患者死于并发症。原位肝移植是终末期肝硬化的有效治疗方法，但是肝移植手术复杂、费用高昂，移植肝源少，术后需长期服用药物移植免疫排斥反应等原因，原味肝移植无法在临床上大范围开展。随着细胞生物工程技术和分子生物学的迅速发展，对干细胞的研究也得以广泛开展，干细胞移植为肝硬化的治疗提供了新的思路和方法，本文就这方面的进展做一综述。

1移植细胞的类型与来源

肝脏中存在的干细胞使得肝脏自身的损伤和修复能保持平衡。成熟肝细胞或胆管细胞处于分化终点，但是在肝脏轻度受损时，这些成熟肝细胞可以通过1-2次有丝分裂使肝脏的功能与体积得以恢复。在肝严重受损时，内源性的肝干细胞（卵圆细胞和小肝细胞）能大量增殖分化为成熟肝细胞和胆管细胞，使肝脏修复。肝脏的这两种修复能力是有限度的，当肝脏的损伤超过其本身的修复能力时，外源性肝干细胞可增殖并分化为肝细胞或类肝细胞，这些外源性肝干细胞可能来源于骨髓、胰腺或胚胎等的干细胞，其数量极少，但增殖能力及其强大。[1]

据其干细胞起源的不同，可应用于肝硬化的干细胞可分为两类：一是肝源性肝干细胞，包括小肝细胞、卵圆细胞，二是非肝源性肝干细胞，主要有胚胎干细胞、脐血干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞等。

1.1肝源性肝干细胞。在胚胎发育过程中，前肠内胚层的成肝细胞逐渐发育成成熟肝细胞及胆管细胞，其中少部分以卵圆细胞和小肝细胞的形式存在，即肝源性肝干细胞。

1.1.1卵圆细胞。正常情况下，肝脏内卵圆细胞的含量少且增生分裂慢，当肝脏切除或损伤后，肝细胞开始活化增生，如果肝细胞增生受到抑制或肝脏损伤严重，卵圆细胞开始活化、增生并分化成肝细胞和胆管上皮细胞，修复肝脏。卵圆细胞容易通过实验模型诱导得到，相对容易分离培养，并有双重分化、克隆增殖的特性，适于实验研究。但是卵圆细胞移植有导致胆管癌或肝细胞癌的倾向，大大限制了其临床应用。

1.1.2小肝细胞。小肝细胞也多在严重肝损伤的情况下转变为肝细胞。它的来源和肝内定位尚不清楚，有些研究者认为小肝细胞是卵圆细胞和成熟肝细胞之间的过渡细胞，但也有人认为它是不同于卵圆细胞和肝细胞的一种独立的肝脏祖细胞。

1.2非肝源性肝干细胞。近年来的研究发现，在一定条件下骨髓造血干细胞、脐血干细胞及胰腺上皮祖细胞等干细胞也可以分化演变为肝细胞或类肝细胞。

1.2.1胚胎干细胞。来源于早期胚胎的胚胎干细胞具有多向分化潜能，在体内外均可分化为肝细胞，这点已被大量的实验所证实。Kei Moriya等[2]将未分化的胚胎干细胞移植到CCl4处理的小鼠的脾脏内，发现未分化的胚胎干细胞分化为肝细胞样细胞，并且无明显肿瘤形成，对肝脏纤维化也有一定的抑制作用。由于伦理学上的原因，胚胎肝脏干细胞的应用受到限制。

1.2.2骨髓干细胞。骨髓干细胞来源广、易采集，且不涉及伦理道德问题，通常被认为是治疗急、慢性肝病最具潜力的供体细胞。骨髓干细胞主要有两大类，一类是造血干细胞（HSC），它是血细胞的起源细胞，另一类则是骨髓间充质干细胞（MSC）。可以很容易的从病人自身血液中即存在骨髓来源的造血干细胞，易于获得，且具有免疫耐受性，不需要进行免疫抑制。AvitaI L等研究证实从骨髓分离的造血干细胞移植入受体

后，可整合到受体肝板，分化为成熟肝细胞并合成尿素。近年来骨髓间充质干细胞也成为热点，王方等[3]将自体骨髓干细胞注入失代偿期肝硬化患者的肝动脉，结果发现全部患者全身症状及消化道症状有一定程度的改善，并且血浆白蛋白水平显著提升、凝血酶原时间改善、TBIL下降，同时外周血白细胞和血小板及AFP无明显变化。

1.2.3脐血干细胞。脐血有充足的间充质干细胞来源，而且脐血的免疫原性较弱，其间充质干细胞更为原始，扩增能力更强，在连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。张丽欣等[4]采用静脉回输和经肝固有动脉、门静脉介入途径移植脐血干细胞治疗失代偿期肝硬化患者共20例，移植后3个月，患者腹腔积液减少率为75%，乏力好转率为80%，肝病面容、肝掌及蜘蛛痣减轻率为70%。

1.2.4脂肪干细胞。脂肪间充质干细胞可能成为大量自体干细胞的理想来源，具有潜在的临床应用价值。谭国胜等[4]将大鼠脂肪间充质干细胞通过门脉及尾静脉移植至CCl4诱导的肝硬化大鼠中，结果表明，细胞移植组动物肝功能损害程度较对照组明显降低，ALB表达水平升高，而病理评分也表明移植组的肝纤维化程度较对照组轻微，门脉组肝假小叶形成不明显，实验数据证明脂肪间充质干细胞能有效改善肝硬化动物模型的肝功能，并在一定程度上抑制肝纤维化进程。

除此之外，还有学者正从事胰腺干细胞神、经干细胞、唾液腺祖细胞等在肝硬化治疗中应用的研究。

2干细胞向肝细胞分化的研究

胚胎发育时肝细胞的分化过程中有大量的细胞因子对其分化起着极其重要的作用，如肝细胞生长因子、表皮生长因子等。在肝干细胞相关的实验研究中，通常先应用多种细胞因子对用于移植的肝脏干细胞进行诱导或修饰，使其分化具有更好的“方向性”。

2.1体外诱导干细胞向肝细胞分化。骨髓干细胞和胚胎干细胞的诱导分化多选择体外诱导方法。在骨髓干细胞方面，吴玉卓等取肝硬化患者骨髓MSCs，用肝细胞生长因子（HGF）、表皮细胞生长因子（EGF）单独或联合诱导MSCs分化为肝样细胞，结果显示肝硬化患者骨髓干细胞生长良好，CD29阳性、CD34阴性，AFP表达、CKl 8阳性，并以时间依赖式产生ALB。由此认为HGF、EGF均能诱导骨髓MSCs分化为肝样细胞，两者在一定程度上具有联合作用。在胚胎干细胞方面，Chinzei等对一株小鼠胚胎干细胞的胚状体进行培养，在其细胞中发现了白蛋白mRNA的表达，并有合成白蛋白及尿素的功能。

2.2体内诱导干细胞向肝细胞分化。体内诱导干细胞向肝细胞分化的实验研究也已有多家成功报道。Theise等通过对同种异基因原位肝移植及性别交叉的骨髓移植进行研究，结果证实肝外循环的造血干细胞在一定条件下（如肝脏损伤）可以入肝并分化为肝细胞及胆管细胞，而肝脏损害的严重程度是决定移入肝脏实质造血干细胞数量的重要因素。

3干细胞治疗肝硬化的移植途径及着床位置

3.1传统肝脏干细胞移植途径。

3.1.1外周静脉移植途径。经外周循环移植干细胞是常用的移植方法，其操作简便，创伤也小，但干细胞在肝损伤区的归巢能力有限，且目前仍没有有效方法能促使干细胞对肝脏组织特异性靶向趋化，故其效果尚不能肯定。

3.1.2腹腔移植途径。腹腔内营养丰富，代谢产物交换面积大，单次可以移植的干细胞数量大，且操作简单。但腹腔移植操作可能引起炎症反应和细菌感染，进一步导致腹膜炎、腹腔粘连等可能。

3.2介入微创式肝脏干细胞移植途径。传统的干细胞移植方法不能保证到达肝损伤损伤区域的干细胞数量，其效果无法肯定，这就促使了应用血管穿刺、导管技术将肝脏干细胞注入至“靶区”的方法的出现。

3.2.1门静脉移植途径。门静脉是介入式移植肝干细胞经常使用的移植途径，门脉血中丰富的营养成分有益于干细胞的生长发育，且门静脉内高浓度的嗜肝细胞因子、局部生长因子等对肝干细胞的分化、归巢也有重要的作用。但该方法出血倾向较高，同时肝硬化门脉高压的患者门静脉中多存在逆肝血流，注入门静脉的干细胞有通过侧支循环分散其他部位的可能，其临床应用有一定限制。

3.2.2经股动脉导管肝动脉移植途径。该途径具有创伤小、操作简单，便于在体外连续或多次注入干细胞悬液等优点，且移植风险较小，肝动脉即使完全阻塞也不会引起肝坏死和门静脉压力增加。黄茂涛等采用经肝动脉自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化患者50例，结果显示：移植1个月后，35例患者纳差、乏力得到明显改善。术后47例患者停止使用利尿剂后未再出现腹水。由此得出结论，经肝动脉自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化可在短时间内提高血清白蛋白，改善肝功能。

3.2.3肝内移植途径。从理论上讲，肝脏本身是于细胞治疗的最佳器官，肝内注射也可以作为干细胞治疗的途径之一。但是此种方法也具有出血倾向，故临床应用上受到患者凝血机制的限制。

3.3脾脏作为移植的着床位置。理论上肝脏本身是肝脏干细胞移植的最佳部位，它能为肝干细胞的增值、分化提供适宜的细胞外基质、高浓度的嗜肝细胞因子和局部生长因子等，是肝脏干细胞向肝细胞定向诱导分化的最佳土壤。近年来的一些研究提示脾脏丰富的血液供应及细胞因子也可满足移植的肝脏干细胞增值和分化要求，同时移植的肝脏干细胞在红髓内停留时间长，更有益于干细胞的生存和分化，形成所谓的“肝化脾”，故脾脏也可成为肝干细胞移植的着床位置。由于脾窦内的巨噬细胞的存在，移植进入脾脏内的肝脏干细胞最终仅有不到30%能到达肝脏，对肝功能恢复的效果有限；另外以脾脏作为着床位置可能引起右心房压力升高，加重门静脉高压等，其临床应用也受到一定限制。

4干细胞在肝硬化治疗中的应用

在肝硬化的早期和中期时，肝功能尚能代偿，进行干细胞移植有助于逆转肝硬化程度、减轻肝组织的损害。降解病理沉积结缔组织的降解及促使肝实质细胞再生是逆转肝纤维化的关键。在结缔组织降解方面，Sun等的研究证实，骨髓源性干细胞移植可以显著降解肝脏结缔组织。在补充实质细胞方面，Kakinuma等将人脐血干细胞植入慢性肝损害的NOD/SCID小鼠体内，发现人脐血干细胞分化的肝细胞定位于小鼠肝脏并改善肝脏功能。

肝硬化晚期到肝功能衰竭时，通过移植具有分化增殖能力的干细胞，使其在体内分化成肝细胞，可以代偿部分肝功能。应用自体干细胞治疗肝硬化失代偿期及慢性肝衰竭已经在临床上开展；亦有实验提示干细胞移植在急性肝衰竭的治疗中也有可能积极作用。曲乃芳等将采集、扩增的雄性大鼠骨髓干细胞经肝静脉途径移植到以D-氨基半乳糖及内毒素制备雌性大鼠肝衰竭模型的肝脏中，观察受体雌鼠临床表现、生化改变、肝脏病变及肝组织Y染色体阳性率。结果显示受体肝衰竭雌鼠在细胞移植后，精神、食欲逐渐好转，生化异常及肝脏病变得以恢复，肝脏可检出Y染色体阳性的供体源性肝细胞；未接受骨髓干细胞移植的对照组雌鼠则全部死亡。由此得出结论骨髓干细胞移植对实验性肝衰竭大鼠具有明确治疗作用。

5干细胞移植治疗肝硬化的临床应用前景与展望

目前，国内外大量动物试验和临床研究已取得了较好的临床应用价值，自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化效果较满意，近期疗效肯定，长期疗效有待进一步观察。尤其是骨髓干细胞，是肝干细胞的来源，同时来源广、易采集及不涉及伦理道德问题，骨髓干细胞被认为在肝硬化的治疗方面具有良好的应用前景。随着技术和理论的臻熟，笔者相信，肝脏干细胞移植必将会在临床上得到广泛的应用，为治疗肝硬化开辟一条新的治疗途径。

参考文献

[1]朱越锋等.肝硬化门脉高压症治疗的新途径―干细胞移植研究进展.国际外科学杂志，2007.34（2）

[2]Moriya， K.， et al.， Embryonic stem cells reduce liver fibrosis in CCl4-treated mice. Int J Exp Pathol， 2008. 89（6）： p. 401-9

[3]王方等.自体骨髓干细胞治疗失代偿期肝硬化患者50例疗效观察.实用肝脏病杂志，2010.13（4）

[4]谭国胜等.脂肪间质干细胞移植对大鼠肝硬化模型的治疗作用.世界华人消化杂志，2009.17（11）